Nuclear Factor I（NFI）蛋白家族是一类重要的转录因子，在哺乳动物中通常包含NFIA、NFIB、NFIC和NFIX四个成员，参与调控多种器官的发育与功能。其中，NFIA、NFIB和NFIX在神经系统发育中发挥关键作用，参与放射状胶质细胞成熟、神经发生及大脑形态发生等关键发育过程。近年来，研究者已在神经发育障碍患者中鉴定出多种NFI基因变异，提示该蛋白家族与神经发育疾病的发生发展密切相关，然而这些变异如何导致疾病的分子机制一直未被阐明。由于缺乏高分辨率的NFI-DNA复合物结构，疾病相关突变如何影响NFI蛋白的DNA识别及转录调控功能，一直难以得到解析，这也制约了针对相关疾病的精准诊疗策略的研发。
近日， 华中师范大学刘珂/闵金荣团队 在ActaBiochimica etBiophysicaSinica在线发表了题为Biochemical and structural studies of NFIA and NFIC reveal a conserved mechanism for specific DNA recognition and provide insight into potential pathogenicity of disease-associated mutations的研究论文。该研究通过解析NFIA和NFIC与DNA的复合物晶体结构，在分子层面揭示了NFI蛋白二聚化及其特异性识别DNA的机制，并系统评估了疾病相关突变对DNA结合能力的影响。上述发现为理解神经发育障碍相关NFI突变的致病机理提供了关键的结构基础与理论依据。
NFI 蛋白由 N 端 DNA 结合结构域（ DBD ）和 C 端转录调控结构域（ TRD ）组成。既往研究提示其 N 端约 240 个氨基酸残基是形成二聚体的关键区域。为验证并深入探索这一机制，研究团队表达纯化了 NFIA 和 NFIC 的一系列截短片段，并通过尺寸排阻色谱（ SEC ）分析其聚集状态。结果显示，较短的 NFIA （ aa 10–174 ）和 NFIC （ aa 10–175 ）片段主要以单体形式存在，而含有更多 C 端序列的 NFIA （ aa 10–205 、 10–221 ）与 NFIC （ aa 10–202 ） 则主要形成二聚体。这些结果表明， NFIA 和 NFIC 的 aa 175-200 区域是介导它们形成稳定二聚体的关键片 段 。
为阐明 NFI 蛋白特异性识别 DNA 的分子机制，研究团队合成了具有二分对称性的双链 DNA （正义链序列： 5’-AAGT TGGCA CCG TGCCA ACTT-3’ ，命名为 N3 DNA ）。 ITC 结合实验表明， NFIA 与 NFIC 的同源二聚体对 N3 DNA 表现出相近的亲和力。随后通过共结晶实验，成功解析了 NFIC 二聚体与 DNA 的复合物结构，以及 NFIA 和 NFIC 单体分别结合 DNA 的复合物结构。结构分析显示，在 NFIC 二聚体中，两个蛋白单体通过位于其 C 端的一段 α 螺旋实现稳定二聚化，而每个单体的 DBD 则以高度保守的构象识别 TGGCA 和 TGCCA 半位点。尽管单体形式的 NFI 蛋白缺乏二聚化区域，但其与 DNA 的结合模式与二聚体中的单体亚基高度一 致 。
结构分析表明， NFIC 二聚体通过氢键和疏水相互作用维持稳定，且氨基酸序列分析显示该家族的二聚化区域高度保守。 ITC 实验表明， NFIC 和 NFIA 的单体与二聚体在结合完整 N3 DNA 时表现出相近的亲和力，但当 DNA 的一个识别半位点发生突变时，二聚体的结合亲和力减弱。进一步综合 DNA 结合实验与复合物结构分析表明， NFIC 二聚体的两个单体结合于 DNA 双链的同一侧。该二聚化构象对两个识别半位点之间的空间间距形成结构约束，因此改变半位点间的核苷酸长度会显著削弱 NFI 二聚体的结合亲和力，而改变间隔区核苷酸组成对其亲和力影响较小。这些结果表明，二聚化增强了 NFI 蛋白对完整二分对称 N3 DNA 的特异性结合 。
NFIC 二聚体与 N3 DNA 的复合物结构显示，两个蛋白单体的 DBD 从相反方向通过各自的 DNA 结合环（ loop1 ）嵌入 DNA 大沟，特异性识别 N3 DNA 的两个半位点。具体而言，第一个单体通过其 loop1 上的氨基酸残基 R117 、 A124 和 K126 识别第一个 TGGCA 位点，而第二个单体采用高度相似的结合模式识别 TGCCA 半位点。氨基酸序列与复合物结构比对表明，该识别机制在 NFI 蛋白家族中高度保守 。
遗传学分析显示，临床鉴定的神经发育障碍相关 NFI 突变大多位于其保守的 DNA 结合结构域。为解析这些突变的致病机制，研究团队选取了在 NFIA 、 NFIB 和 NFIX 中均被报道的对应位点，在 NFIA 蛋白中引入定点突变，并评估了其对 DNA 结合能力的影响。 ITC 结合实验结果表明，在检测的疾病相关突变中， R116G 、 K125E 和 D118H 突变均显著降低了蛋白与 DNA 的结合能力。进一步的复合物结构分析表明，这些突变主要通过直接破坏与 DNA 碱基的相互作用，或改变 DNA 结合环的局部构象，从而损害了 NFIA 的 DNA 结合功 能 。
通过对 NFIA 和 NFIC 聚集状态及其 DNA 复合物结构的解析，本研究从分子层面揭示了 NFI 家族通过保守二聚化界面组装，并特异性识别二分对称 TGGCA(N3)TGCCA DNA 序列的机制。研究进一步通过结构与结合实验，评估了神经发育障碍相关 NFI 突变对其 DNA 结合能力的影响，为已知患者变异提供了机制性功能注释。这些发现不仅拓展了对 NFI 蛋白转录调控机制的理解，也为相关疾病的机制研究与精准诊疗策略的开发奠定了关键的理论基础 。
原文链接：https://www.sciengine.com/ABBS/doi/10.3724/abbs.2025236
制版人：十一
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