免疫荧光（IF）技术以其高灵敏度和多色标记能力，成为细胞生物学研究的重要工具。然而，一个常见的干扰因素——样本自发荧光——常常令研究者困扰，甚至误判为阳性信号。本文将深入剖析自发荧光的来源，并提供实用的破解策略。

自发荧光主要来源于两大类。

第一类是交联固定诱导的自发荧光。

当使用多聚甲醛、福尔马林、戊二醛等醛类固定剂时，醛基会与组织中的蛋白质、核酸等分子上的氨基发生反应，形成席夫碱等产物，这些产物在宽光谱范围（蓝、绿、红光）内都能产生荧光信号，其中戊二醛的诱导作用最强。这是IF实验中最常见的自发荧光来源。解决措施：考虑换用甲醇、乙醇等醇类固定剂，它们通常不会诱导此类荧光。

第二类是内源性物质的自发荧光。

生物样本中某些天然物质本身就具有荧光特性。例如，红细胞中的血红素基团（因其卟啉环结构）会发出红色荧光；随着年龄增长在神经元、心肌等细胞中累积的脂褐素颗粒，在500-695 nm波长范围内有强烈发光；此外，核黄素、弹性蛋白等也是常见的“发光大户”。解决措施：针对血红素，可在组织固定前用PBS充分灌注，洗去大部分红细胞。针对脂褐素，可使用疏水性的苏丹黑B进行处理，它能结合富含脂质的脂褐素颗粒，从而掩盖其自发荧光（需注意苏丹黑B本身在远红光通道有荧光，设计多色实验时应避开该通道）。

那么，如何判断观察到的荧光是特异信号还是自发荧光呢？

最直接有效的方法是设置一个空白对照（或称自发荧光对照）：即对处理好的样本不孵育任何一抗和二抗，直接在各荧光通道下观察。如果仍有荧光信号，则证明存在自发荧光，在分析实验结果时需将此背景扣除。

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