Nat Cell Biol | 揭示核孔之门：核转运因子如何重塑动态屏障之谜|孔道|屏障|核孔之门|结构域|蛋白|野生型

撰文丨易

核孔复合体是镶嵌在核膜上、介导大分子在细胞核与细胞质之间选择性运输的关键通道。其选择性的核心，在于由核孔蛋白的FG（苯丙氨酸-甘氨酸）重复序列结构域构成的动态运输屏障。这些FG结构域是无序的，像 “ 面条 ” 一样从中心孔道的支架上延伸出来，既能阻挡非特异性大分子的自由扩散，又能通过与被称为核转运因子（Karyopherins,Kaps）的特异性转运受体相互作用，高效地让货物分子通过。然而，这个屏障在分子层面究竟如何组织一直存在争议。过去的研究主要基于体外模型，如FG水凝胶、高分子刷或生物分子凝聚体，但这些模型是静态或宏观的，无法完全反映在真实的、具有纳米级对称结构的核孔内FG结构域的动态行为。此外，在电子显微镜下观察到的、位于核孔中心的无定形结构 ——“ 中心栓 ” 的身份和功能也一直是个谜。因此，迫切需要一种能够在接近生理时间和空间尺度上，直接观察天然核孔内FG屏障原位动态结构的技术，以揭示其工作原理。

近日，瑞士巴塞尔大学Roderick Y. H. Lim和美国洛克菲勒大学Michael P. Rout在Nature Cell Biology期刊上发表题为Karyopherins remodel the dynamic organization of the nuclear pore complex transport barrier的研究论文，首次在毫秒级分辨率下，直接观察并揭示了核孔复合体运输屏障的动态本质：核转运因子与FG结构域在核孔特有的对称几何约束下，共同形成了一个由中心动态“栓”和外围波动“环”组成的纳米级功能分区，从而高效调控核质运输。

本研究采用了一种名为高速原子力显微镜的前沿技术作为核心手段，并结合了多种体外和体内方法进行交叉验证。高速原子力显微镜能以约1毫秒的时间分辨率对生物样本进行成像，其施加的探测力极低，非常适合研究脆弱、快速运动的FG结构域，而不会造成明显干扰。

首先，研究发现核孔中心的 “ 中心栓 ” 是一个高度动态的、由核转运因子和FG结构域共同组成的纳米簇。在分离的野生型酵母核孔中，大部分都含有中心栓。高速原子力显微镜的实时成像显示，这个栓并非固定不动的塞子，而是在孔道中心区域具有相当的移动性，可以探索孔道的宽度。更关键的是，观察到周围的FG结构域像触手一样不断从支架上波动，与中心栓发生碰撞、融合和分离。当部分核孔在长时间放置后中心栓 “ 消失 ” 时，其孔道内FG结构域的波动变得更为开放和随机，失去了中心的凝聚力。质谱分析证实，含有中心栓的核孔中稳定结合了大约15-20个主要的核输入因子Kap95分子，而在中心栓缺失的核孔中，超过一半的这种长期结合的Kap95及其接头蛋白被替换或丢失。体外重建实验完美地支持了这一关联：当向中心栓缺失的核孔中添加外源的Kap95时，能够以剂量依赖的方式重新形成中心栓样结构，并且其高度和垂直范围与天然含有中心栓的核孔相似。这表明，中心栓的本质是Kap与FG结构域相互作用形成的一个动态、稳定的复合物集群，它显著增加了运输屏障的垂直空间占据。

其次，研究深入探讨了FG结构域浓度和性质对屏障功能的影响，发现过犹不及的精细平衡。通过分析两种不同的核孔突变体，作者发现了有趣且关键的对比。一种是FG结构域大量缺失的突变体，其FG重复浓度比野生型降低了约51%。另一种是通过基因工程延长了主要FG核孔蛋白Nsp1的结构域，使其FG重复浓度比野生型高出约30%。在延长FG的突变核孔中，虽然Kap95在核孔处的富集量反而增加了，但活体运输实验却表明，无论是通过Kap60-Kap95途径的主动运输，还是一个150 kDa大蛋白的被动扩散，其效率都显著下降。与此同时，高速原子力显微镜观察到这些突变核孔内的FG结构域形成了 “ 过度伸展、相互缠结 ” 的筛网状结构，其动态波动明显变慢。这清晰地表明，过高的FG密度会导致屏障过紧，形成一个动力学上更为粘稠的环境，反而阻碍了高效运输。这推翻了简单的“FG越多屏障越强”的线性模型，揭示了核孔屏障的效能依赖于FG结构域在开放性与选择性之间的动态平衡。

再者，研究通过对比天然核孔与体外模型，有力地质疑了传统体外FG水凝胶作为核孔屏障模型的代表性。体外用Nup116FG等形成的选择性水凝胶，虽然能像核孔一样允许Kap通过而排斥大的惰性蛋白，但其微观结构却与天然核孔大相径庭。高速原子力显微镜显示，这些水凝胶表面粗糙，呈静态的颗粒状聚集，并且布满了大小不一、形状不规则（平均宽度约50纳米）的孔洞，更像一块充满孔洞的海绵。更重要的是，其内部存在长约1微米、直径约25纳米的淀粉样纤维，结构非常刚性。即使向其中添加Kap95，也观察不到任何类似中心栓的动态结构形成或局部的融化重塑，仅仅表现为水凝胶高度的增加。这说明体外自组装形成的是热力学稳定的、具有淀粉样纤维特征的静态网络，完全不同于在核孔几何限制下形成的、依赖Kap动态重塑的纳米级屏障。

最后，为了验证几何约束的关键作用，作者构建了被称为 “ NuPODs ” 的人工纳米通道，其大小、八边形截面都模拟了真实的核孔，并在内壁精确锚定了FG结构域。实验结果非常明确：在空的DNA支架中看不到动态行为；加入FG结构域后，通道内出现了类似无中心栓天然核孔的动态波动；而进一步添加Kap95后，奇迹般地在人工通道的中心诱导形成了一个可移动的、类似中心栓的纳米簇，其高度和动态行为与Kap95浓度的关系，完美地复现了在真实核孔中观察到的现象。这一实验证明，核孔运输屏障的动态组织并非FG结构域和Kap相互作用的必然产物，而是必须发生在类似核孔（约50纳米宽、旋转对称）的特定纳米尺度几何环境中才能涌现的特性。正是这种精确的物理架构，使得FG结构域的动态波动和Kap的结合能够协同作用，自发形成一个动态分区的、功能性的纳米机器。

综上所述，本研究通过高速原子力显微镜等技术，清晰地揭示了核孔运输屏障的动态组织机制，其核心发现是：核转运因子通过对锚定在NPC通道内、本质无序的苯丙氨酸-甘氨酸（FG）结构域的原位动态重塑，将屏障划分为一个中心可移动的“栓”和周围快速波动的“环”两个功能区域，而这种结构的形成强烈依赖于核孔对称的纳米几何约束。这与体外FG结构域组装的许多宏观性质形成鲜明对比。

https://doi.org/10.1038/s41556-025-01812-9

制版人：十一

学术合作组织

（*排名不分先后）