图 1.共焦拉曼显微镜设置。
介绍
在过去的十年中，高精度光谱仪、科学相机技术和新颖的数据分析算法的开发取得了重大进展。这些进步使拉曼光谱成为复杂生物细胞和组织相关研究的实用且强大的工具。拉曼光谱测量的非侵入性、简单、快速和高度可重复的特性使其成为癌症诊断、微生物学鉴定以及防伪食品和药物筛查等多种备受瞩目的应用的有力候选者。
尽管紧凑型台式拉曼光谱仪对于许多研究和工业实验室来说相对便宜，但集成共焦拉曼显微镜系统(可以说是组织分析最理想的工具之一)仍然价格高昂，这使得资金有限的中小型机构和实验室更难以购买它们。
在本文中，我们证明可以使用紧凑型Teledyne Princeton Instruments IsoPlane ® 81成像光谱仪将标准光学显微镜转换为高性能共焦拉曼显微镜。
实验装置
共焦装置示意图如图 1 所示。耦合光学组件由两个IsoPlane 81预对准立方体(拉曼和聚焦)构建。两个带有 FC 适配器的光纤端口用于激光和信号收集光纤。使用单模 532 nm 激光器作为激发源。拉曼散射通过光纤耦合至IsoPlane 81成像光谱仪。使用标准相机端口适配器将耦合组件连接到Olympus BX51 正置显微镜。基于 CUBE 的专有耦合非常简单，并且需要最少的对准工作。共焦是通过仔细选择耦合光纤的纤芯尺寸来实现的。
脑组织和有丝分裂蛔虫卵样本用于测量。将样品沉积在标准显微镜载玻片上。
结果
图 2 显示了在曝光时间为2 秒的情况下在样品平面和显微镜物镜之间的不同相对位置收集的532 nm 拉曼光谱。使用2 µm的步长来测量深度轮廓。
图 2A 显示了10 µm 步长的代表性光谱。图2B是~2950 cm -1处的峰的背景校正强度分布。图2C是样品的彩色显微镜图像。广泛的背景来自于玻璃基板的荧光。样品在~1400、~1670 和~2950 cm -1处的特征清晰可见。
图 2.有丝分裂(蛔虫卵)样本的深度剖面。
根据该装置中使用的光学器件，我们估计横向空间分辨率为 1.3 µm，FWHM 深度分辨率为 4.2 µm。在实践中，许多因素都会对这些数字产生影响，包括盖玻片的类型和厚度、样品的透明度以及浸油的厚度、折射率和光学特性。 (当前研究中使用的是干物镜。)
图 3 分别显示了干燥脑组织和缓冲脑组织的532 nm 拉曼光谱。缓冲液中脑组织的光谱主要由~3450 和~1700 cm -1处的水拉曼特征决定。可以清楚地观察到两个样品的CH/NH 拉伸和指纹区域中的拉曼峰。
图 3.风干脑组织和水性缓冲液中脑组织的 532 nm 拉曼光谱。
结论
我们展示了使用标准正置显微镜的共焦拉曼显微镜设置。实现了出色的空间和深度分辨率。结合IsoPlane 81科学成像光谱仪，在相对较短的曝光时间内收集到高质量的拉曼光谱。耦合光学器件的设计可以轻松地用于其他正置或倒置显微镜。对于内置镜筒透镜的显微镜，需要配套的镜筒透镜(如图 4 所示)。
图 4.带镜筒透镜的显微镜耦合光学器件示意图。
当前设置的横向和轴向分辨率很大程度上取决于所使用的光学器件。通过仔细选择合适的光纤准直器、光纤芯尺寸、聚焦透镜和物镜，可以获得更高的分辨率。
我们期望这种简单易用的共焦设计能够使该领域的许多研究人员受益。
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