在甲醇无机盐培养基中，经过基因改造的菌株将廉价的甲醇转化为L-精氨酸，一套全新的合成生物学工具包首次让这一高效转化成为可能。近日，中国科学院天津工业生物技术研究所（以下简称“天津工生所”）成功开发出一套针对甲醇芽孢杆菌的合成生物学使能技术，突破了这一一碳生物制造潜力底盘的技术瓶颈，现该成果已发表于国际期刊《Cell Reports》。

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据悉，该技术包括高效的DNA电转化方法、基于热稳定CRISPR-Cas9系统的基因组编辑技术、用于基因稳定表达的染色体中性位点以及用户友好的生物设计工具。这套工具包包含了多个关键技术创新，从基础转化效率提升到复杂的基因编辑和代谢调控，形成了一套完整的技术体系。研究团队利用该工具包成功构建了无质粒、表型稳定的工程底盘，并改造底盘首次实现了以甲醇为唯一碳源生产L-精氨酸。

研究中，天津工生所的团队系统优化了DNA电转化方法，将转化效率较原方法提升了1000倍，为后续遗传操作奠定了基础。同时，通过比较不同热稳定CRISPR-Cas9系统，研究团队选择ThermoCas9进行基因编辑测试，结果显示该系统具有超过98%的靶向致死率。使用1kb同源臂即可实现高效的基因组敲除，敲除4kb以内片段的效率接近100%，并可实现40kb大片段的敲除以及双基因的同时敲除。

随后，利用这套先进的基因编辑系统，研究团队对甲醇芽孢杆菌内源质粒pBM19和pBM69以及染色体上的甲醇代谢基因拷贝进行了精准敲除。研究结果显示，pBM19质粒携带6个甲醇代谢基因，质粒敲除菌完全丧失了在甲醇无机盐培养基中生长的能力。而携带限制性内切酶BmeTI的pBM69质粒的敲除菌，可以显著提高无m6A甲基化质粒的转化效率。

研究还发现，染色体拷贝的3-己酮糖-6-磷酸合成酶编码基因hps、6-磷酸-3-己酮糖异构酶编码基因phi以及磷酸果糖激酶编码基因pfk的单敲除菌株，几乎完全阻断了甲醇代谢。这一发现表明染色体拷贝的这些基因对甲醇代谢具有重要作用，为理解甲醇芽孢杆菌的代谢机制提供了关键科学依据。

除了基因编辑技术，研究团队还鉴定和评估了12个用于基因稳定整合和表达的染色体中性位点。这些中性位点在不同条件下对菌体生长影响较小，并具有不同的表达水平，为基因表达的精细调控提供了广泛选择。利用上述基因编辑技术与中性位点，研究团队将对甲醇代谢至关重要的19kb大质粒pBM19整合至中性位点进行表达，同时敲除内源质粒，获得了无质粒的新型工程底盘。通过适应性进化，该底盘展现出稳定且强健的生长特性，既避免了质粒丢失风险，也消除了菌株退化的隐患。这种稳定的工程底盘为后续的工业化应用提供了可靠的基础，解决了传统质粒依赖型菌株在长期培养中容易退化的问题。

甲醇芽孢杆菌作为一种独特的嗜热且质粒依赖型的甲基营养菌，其最适生长温度高达50–55°C，并能在海水培养基中快速生长。高温发酵可降低冷却能耗、减少杂菌污染、提高反应效率并节约淡水资源，这使得甲醇芽孢杆菌在工业应用中具有显著优势。天津工生所研究团队构建了甲醇芽孢杆菌的基因组规模代谢网络模型iBM822，并将其整合至CAVE和QHEPath等途径可视化与途径设计云平台上，方便研究人员使用。利用该模型模拟预测了甲醇芽孢杆菌代谢甲醇合成L-精氨酸的代谢途径，并通过基因敲除和过表达研究了L-精氨酸合成的调控机制，构建得到利用甲醇生产L-精氨酸的初代工程菌。该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、天津市杰出青年科学基金等项目的支持。

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