【JD-ZW216山东竞道光电厂家品质保障，值得信赖】一、实验前准备
样本采集与处理：
采集抗凝血、淋巴结或脾脏组织样本
组织样本按1:5比例加入PBS匀浆，取上清液待检
所有样本在2-8℃保存不超过24小时，长期保存需置于-70℃
核心试剂与仪器：
试剂盒：选用国家认证的ASFV荧光PCR检测试剂盒
主要仪器：实时荧光PCR仪、核酸提取仪、离心机、生物安全柜
耗材：无核酸酶离心管、带滤芯吸头、PCR反应管
二、标准化操作流程
第一步：核酸提取(30分钟)
在生物安全柜内，取100μL样本加入核酸提取裂解液
按照磁珠法或柱式法试剂盒说明书操作
最终洗脱获得50-100μL DNA模板，立即检测或-20℃保存
第二步：PCR反应体系配制(冰上操作)
采用20μL反应体系：
2×PCR预混液：10μL
引物探针混合液：2μL(针对ASFV p72基因保守区)
DNA模板：5μL
无核酸酶水：3μL
每个批次必须设置：
阳性对照：ASFV标准品
阴性对照：无核酸酶水
内标对照：监控提取与抑制情况
第三步：上机检测
按以下程序设置PCR仪：
预变性：95℃ 30秒
循环阶段(45个循环)：95℃ 5秒 → 60℃ 30秒(在此步骤收集荧光信号)
荧光通道选择：FAM通道检测病毒，HEX/VIC通道检测内标
三、结果判读标准
阳性：Ct值≤35，且有典型的S型扩增曲线
可疑：Ct值35-38，需重复检测
阴性：无Ct值或Ct值≥38，且内标正常
无效：阳性对照未检出或阴性对照出现扩增，实验需重做
四、质量控制要点
分区操作：严格遵循试剂准备区、样本处理区、扩增分析区三区分离
防污染措施：使用带滤芯吸头，实验后用10%次氯酸钠擦拭台面
人员防护：在生物安全二级(BSL-2)实验室进行，穿戴个人防护装备
仪器校准：每季度对PCR仪进行光路校准和温度验证
本标准化流程基于OIE推荐方法建立，可实现对非洲猪瘟病毒DNA的灵敏、特异检测，检测下限可达10拷贝/μL，为疫情早期诊断提供可靠技术支撑。
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