CTM丨范小英团队开发高通量单细胞表观多组学测序技术SpliCOOL-seq|dna|染色质|甲基化|细胞|范小英|高通量

DNA 甲基化与染色质可及性是调控细胞特异性基因表达的关键表观遗传机制。 DNA 甲基化主要发生在 CpG 二核苷酸上，通过阻碍转录因子结合或招募甲基结合蛋白来介导转录沉默。染色质可及性则反映了核小体定位与调控元件的活性，决定了转录机制及增强子 - 启动子相互作用对 DNA 的空间可及性。这两种表观遗传模式的相互作用对维持细胞稳态至关重要，例如在原始生殖细胞中，全基因组 DNA 甲基化擦除与染色质重塑同步发生，以重置细胞多能性。在肿瘤中，致癌基因启动子的低甲基化与抑癌基因的高甲基化常伴随调控区域的染色质压缩【1–4】。

同时检测全基因组 DNA 甲基化与染色质可及性并进行整合分析，能够全面揭示生理与疾病状态下表观遗传的协同调控机制，为生物标志物发现与治疗干预提供新机遇。目前已有多种单细胞多组学技术（如 scCOOL -seq 、 scNMT -seq 等）能够实现同一细胞内多种表观遗传信息的同步测量。然而，这些技术均依赖于单细胞裂解液，导致细胞通量严重受限，且成本高、耗时久【5,6】。因此，发展能够同步检测全基因组 DNA 甲基化与染色质可及性的高通量单细胞测序技术仍面临挑战。

近日，广州国家实验室的范小英团队在Clinical and Translational Medicine杂志上发表了题为High-throughput single-cell DNA methylation and chromatin accessibility co-profiling withSpliCOOL-seq的文章。在这项研究中，研究团队开发了一种名为SpliCOOL-seq的多组学测序技术（图1），能够同时对数千个细胞的全基因组DNA甲基化和染色质可及性进行分析。通过整合原位 GpC 甲基化、通用 Tn5 标签化以及组合条形码技术， SpliCOOL -seq 实现了更高的灵敏度和可扩展性。借助这项技术，研究团队深入探究了原发性肺腺癌，能够识别肿瘤病灶内的肿瘤亚克隆，并发现与患者生存相关的新型 DNA 甲基化生物标志物（如 FAM124B 、 SFN 、 OR7E47P ）。此外，还证明了肿瘤亚克隆中存在加速的表观遗传衰老和有丝分裂活动，为肿瘤发生提供了新的见解。

首先，为评估 SpliCOOL -seq 解析细胞类型特异性 DNA 甲基化与染色质可及性的能力，研究团队将其应用于 A549 、 H460 和 SK-MES 三株肺癌细胞系。分析显示，所有细胞在转录起始位点（ TSS ）均呈现 WCG 甲基化水平下降，而基因体区域甲基化最高。不同细胞类型间全基因组甲基化水平与染色质可及性并不简单对应，揭示了表观共调控的复杂性。基于 WCG 和 GCH 甲基化数据均可清晰区分三种细胞类型；与 scATAC -seq 数据的对比验证了 SpliCOOL -seq 所检测的核小体缺失区域（ NDR ）的真实性，且两者鉴定的细胞类型特异性可及区域及富集转录因子基序高度一致。此外， SpliCOOL -seq 亦能准确捕获不同癌细胞的拷贝数变异（ CNV ）。综上，该技术实现了在同一单细胞内对 DNA 甲基化与染色质可及性的高灵敏度、高精度整合分析。

随后，研究团队利用 SpliCOOL -seq 成功解析了肺癌细胞的表观遗传异质性，并取得系列重要发现（图2）：

1. 揭示DNMT抑制剂作用新模式：研究发现，两种常用的 DNA 去甲基化药物（ 5- 氮杂胞苷和地西他滨）虽都能引起全局 DNA 去甲基化，但其作用模式存在显著差异，靶向区域各有偏好，这为临床合理化用药提供了新见解。

2. 发现肺腺癌肿瘤内亚克隆：在对临床肺腺癌组织的分析中， SpliCOOL -seq 不仅区分了癌旁与癌组织细胞，更在肿瘤内部鉴定出具有不同拷贝数变异和表观遗传特征的两个肿瘤亚克隆（ PC1 和 PC2 ），以及一组已出现基因组异常但表观遗传状态仍接近正常的“癌旁癌变细胞”（ AC ），为理解肿瘤早期演化提供了新视角。

3. 鉴定新型预后相关甲基化标志物：通过整合分析，团队发现了一批与肺腺癌患者生存显著相关的 DNA 甲基化标志基因，如 FAM124B 、 SFN （ Stratifin ）、 OR7E47P 等。其中，团队通过 CRISPR 基因敲除和功能实验验证了 SFN 基因在促进肺癌细胞增殖和迁移中的关键作用。

揭示癌细胞表观遗传“加速衰老” ：研究首次在单细胞层面发现，肿瘤细胞表现出明显的表观遗传年龄加速和细胞分裂速率加快，且与正常细胞共享部分衰老相关的甲基化信号，提示衰老与肿瘤发生存在共同的表观遗传基础。

图 2. SpliCOOL -seq 解析肺癌细胞表观异质性及表观衰老

综上所述，本研究提供了一种高通量单细胞测序技术，能够在单个细胞内同时对全基因组 DNA 甲基化和染色质可及性进行平行分析。这种集成方法在阐明不同细胞状态下的基因调控相互作用方面具有巨大潜力。 SpliCOOL -seq 能够实现高分辨率、多模态的单细胞表观遗传学分析，为发现癌症生物标志物提供了一个强大的平台。其应用揭示了新的治疗靶点和早期诊断标志物，突显了其在精准肿瘤学中的潜力。

原文链接：http://dx.doi.org/10.1002/ctm2.70584

制版人：十一

参考文献

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