VOL 3742
与单基因突变相关的自闭症治疗，有可能进入快车道。
2026年1月27日，国际顶级期刊《细胞》（Cell）杂志在线发表中国科学院深圳先进技术研究院路中华教授团队的最新研究成果。
该团队与北京大学第一医院合作，开发了带有易位连接的腺相关病毒（AAVLINK），使稳定、高效的大基因递送成为可能。
腺相关病毒（AAV）是目前基因治疗中最常见的基因递送载体，但受限于其有限的包装容量（极限容量约为 4.7kb 至 5.0kb），目前已知的自闭症风险基因中，有 37.5% 的基因都大到无法用单个 AAV 运送。
路中华团队开发的AAVLINK及其迭代版本AAVLINK2.0，利用一种叫作“ Cre/lox 介导的分子间 DNA 重组“技术，将大基因拆分为2-3段，用2-3个AAV同时运送到细胞内后重组，从而突破单个AAV容量不足的问题。
利用该技术，路中华团队构建了一个涵盖193 个与遗传性疾病相关的大基因、五种基于 CRISPR 的基因工具的载体库，其中166个是与自闭症相关的基因，包括SHANK3、CHD8、SYNGAP1、SCN1A等。
其中，SHANK3（费兰-麦克德米德综合征）、 SCN1A（Dravet 综合征）等已在试验阶段的基因疗法，有可能因此缩短临床应用的时间。
文 | 谭万能
AAVLINK方案示意图、迭代过程、动物实验结果、198个基因库和5个可递送的基因编辑工具（图源：doi.org/10.1016/j.cell.2025.12.039）
如果把基因治疗中的基因递送比作一次“送快递”，那么腺相关病毒（AAV）无疑是目前生物医药界公认的金牌快递员。它安全、不致病，还能长期驻留在细胞里工作。
但这位金牌快递员有一个致命的弱点：它的“随身行李箱”太小了。
AAV 是一种非常微小的病毒，它的衣壳空间决定了其装载基因的极限容量约为 4.7kb 至 5.0kb。但许多重大的遗传性疾病，其致病基因都远远超过这个荷载：
● 杜氏肌营养不良症（DMD）：其所需的抗肌萎缩蛋白基因长达 14kb，是 AAV 容量的近 3 倍。
● Dravet 综合征（婴儿严重癫痫）：所需的 SCN1A 钠通道基因达到 6kb。
● 自闭症谱系障碍（ASD）：统计显示，在 ASD 风险基因中，有 37.5% 的基因都大到无法用单个 AAV 运送。
为了把这些大基因递送到目标细胞，科学家想了很多办法，比如蛋白质反式剪接 （Intein）、RNA 反式剪接 （StitchR） 以及传统 DNA 重组 （tsAAV）。
但这些方法在DNA拆分位点选择的灵活性、复原的效率、产物的纯净度等方面，都或多或少的存在不足。
为克服这些缺陷，路中华团队开发了一种名为AAVLINK（AAV 易位衔接）的新策略。
它借鉴了类似“宜家家具”的运输哲学，将一个大基因拆分为两个（双载体）甚至三个（三载体）较小的片段，分别装入不同的 AAV“快递箱”中。
但这也带来了一个新的技术挑战：如何在细胞核这个微观的“房间”里，把拆散的基因严丝合缝地拼回去？
AAVLINK 利用 Cre/lox 介导的分子间 DNA 重组技术，通过重组酶（Cre）去识别并操作特定的识别位点（loxP），从而实现对 DNA 片段的精准剪切、倒置或易位连接。
AAVLINK流程示意图（图源：http://aavlink.com/）
具体步骤如下：
1. 分头入户：携带不同基因片段的 AAV 同时感染同一个细胞。
2. 召唤焊工：载体中携带的Cre重组酶，像一个精准的焊接工，能识别 DNA 两端的特定接口（lox位点），将两段分离的 DNA 物理连接在一起。
3. 无痕精修：焊接完成后，DNA 上会留下一段多余的接口痕迹（人工内含子）。此时，细胞自带的“剪接系统”会像装修工一样，把这段多余痕迹切除，最终在 mRNA 水平上复原出全长基因。
实验数据显示，这种 DNA 维度的重组效率极高。在修复自闭症相关的 Shank3基因时，AAVLINK 的效率比现有的蛋白质拼接技术（Intein）高出了 36.6 倍。
为了防止Cre重组酶在完成基因重组后还驻留在细胞内，并错误地切割人体自身的基因组（伪位点效应），路中华团队在验证了AAVLINK方案的可行性、稳定性和准确性的基础上，对它的安全性进行了升级。
AAVLINK的迭代过程（图源：http://aavlink.com/）
在升级版的 AAVLINK 2.0 版本中，研发团队为 Cre 设计了“任务完成即自毁”的三重保险：
●第一重：断电（表达自终止）。基因重组一旦完成，Cre 的基因编码区就会自动与供能元件（PolyA）断开，使其无法继续产生新的酶。
●第二重：静音（超弱启动子）。放弃强启动子，改用超弱启动子 SCP1。这就像让安装工“悄悄进村”，只产生刚好够用的微量酶，绝不惊动免疫系统。
●第三重：销毁（降解标签）。这是最核心的改进。科学家给 Cre 贴上了一个“垃圾标签”（UDeg3a）。细胞内的清洁工（蛋白酶体）一看到这个标签，就会在 Cre 完成工作后迅速将其降解销毁。
结果显示，在 2.0 版本中，重组发生后 Cre 的残留水平低于检测限。
166个自闭症基因的“拆装”方案
为了验证这一技术的可行性，路中华团队针对两种难治性遗传病进行了动物实验。
1. 费兰-麦克德米德综合征（PMS）
费兰-麦克德米德综合征（PMS）是一种严重的神经发育疾病，由 SHANK3 基因缺失引起（该基因长 5.4kb，超载）。
利用 AAVLINK 将其拆分递送入小鼠脑部后，不仅恢复了关键蛋白的表达，小鼠的重复刻板行为（如不停理毛）也消失了，社交功能得到恢复。
SHANK3是最早有基因治疗方案的自闭症风险基因，其核心专利的持有者冯国平教授也是路中华留学杜克大学时的博士生导师。AAVLINK方案的面世，或将加速PMS基因疗法的落地。
2. Dravet 综合征
Dravet 综合征是一种致死率极高的婴儿期癫痫，致病基因 SCN1A 长达 6.0kb。在实验中，未治疗的患病小鼠生存率不足 50%。
而经过 AAVLINK 全身治疗后，小鼠的生存率飙升至近 90%，神经元放电功能恢复正常。
包括上述两个基因在内，路中华团队从 SFARI Gene 数据库（全球最权威的自闭症基因数据库）中筛选了166符合以下三个标准的基因，并构建了”运输“和”拆装“方案：
●单基因致病性：绝大多数单基因自闭症是由功能缺失（Loss-of-Function, LoF）或单倍体不足（Haploinsufficiency）引起的 。这意味着只要这个特定基因的一个副本坏了，产生的蛋白质不够用，就会导致疾病。
●大片段限制：编码序列（CDS）长度超过 4 kb 。这类基因以往无法装入单个 AAV（约 4.7 kb 上限），因此是基因治疗的“处女地”。
●临床适用性：适合通过“基因替代（Gene Replacement）”疗法进行修复，即通过 AAVLINK 送入一个正常的基因副本 。
198个基因“拆装”方案及效果验证（图源：doi.org/10.1016/j.cell.2025.12.039）
具体包括SFARI三个得分等级，即Score 1-3的基因。比如极高置信度（SFARI Score 1）里的：
●SHANK3：导致费兰-麦克德米德综合征（PMS）的核心基因。它是突触后致密区的关键支架蛋白，其缺失是单基因自闭症最典型的代表之一 。
●CHD8：一种染色质重塑因子。CHD8 突变被认为是自闭症中最常见的单基因致病因素之一。
●SYNGAP1：编码一种在突触中调节神经元兴奋性的酶，缺失会导致智力障碍和自闭症 。
●SCN1A：导致Dravet 综合征（婴儿严重癫痫）的核心基因。
●SCN2A：编码钠通道蛋白。其功能缺失突变通常与自闭症和发育迟缓相关 。
●RAI1：导致史密斯-马吉利综合征（Smith-Magenis Syndrome），患儿表现出明显的自闭症行为特征 。
●CACNA1C：与 Timothy 综合征相关，该综合征有极高比例的患儿被诊断为自闭症 。
自闭症基因治疗的新时代来临？
除了直接将大基因递送到细胞内以外，AAVLINK也支持将基因编辑工具的直接递送。例如高精度的碱基编辑器（BE）和先导编辑器（PE），它们的体积通常在 5kb 到 6.5kb 之间，以前的单个AAV也根本拉不动。
有的时候，为了能够让AAV将编辑器运到细胞中，研究人员还不得不针对编辑器进行专门设计。比如我们之前报道的仇子龙教授团队针对MEF2C基因的基因编辑治疗，就采用类似的方法。
AAVLINK 2.0 系统成功复原了大型碱基编辑器 ABE8e 和 YE1-BE4max 。
在针对高血脂症靶点 Pcsk9 的实验中，AAVLINK-ABE8e 在小鼠体内的 A-to-G 编辑率达到了惊人的 16%，并显著降低了血液中的 PCSK9 蛋白水平。
同时，AAVLINK 的出现，也使得标准的 SpCas9 工具完整递送成为可能。
通过双载体拆分 SpCas9（切点于 c.2682），使得两枚载体可以各自携带强大的启动子和多条 sgRNA 。
实验证明，重组后的 SpCas9 在小鼠肝脏中实现了对 Rosa26 位点的精准切割，成功率与质粒转染水平相当 。
AAVLINK目前支持SpCas9, ABE8e, YE1-BE4max，dCas9-VPH和CRISPRoff这五个基因编辑工具的递送，实现体内突变的修复。
目前，包括166个自闭症基因在内的198个基因和5个基因编辑工具，均可在团队构建的名为 AAVLINK Resource （http://aavlink.com/）的网站查询具体“拆装方案”，涵盖自闭症、肌肉萎缩症、耳聋等多个领域。
需要提醒读者的是，虽然该技术的出现可能加快自闭症基因治疗的步伐，也需要注意，单纯因为功能缺失、拷贝数变异等原因导致的自闭症，占自闭症群体的总量并不多。
同时该方法目前也仅仅完成动物试验，且试验的多是神经特异性启动子（虽然对自闭症来说是好事），具体的方法，在灵长类生物或者人体内的协同转导效率如何，能否稳定高效安全的实施，也有待检验。
递送内容
类比
工作原理
目标
基因片段
（cDNA）
“加装备件”
将一个正常的基因副本送入细胞，让细胞根据这个副本生产缺失的蛋白质。
补偿缺失或功能异常的基因。
基因编辑工具（CRISPR）
“现场手术”
递送一套“手术器材”（如Casd9剪刀和sgRNA导航）直接对细胞内原有的错误DNA进行剪切、删除或修正。
永久性地更改细胞自身的基因组。
基因治疗的两种方法
但该方法的出现，将载体技术与编辑工具这两个过去经常被视为两个独立的研发方向，实现了有机结合，即以后的基因治疗，不管是递送基因片段，还是递送编辑工具，在载体方面，会有一个稳定高效的选择。
*本文经上海交通大学医学院松江研究院资深研究员仇子龙审核发布。
参考资料：
1. https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.12.039
2. https://www.eurekalert.org/news-releases/1114326
3. http://aavlink.com/
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