口蹄疫病毒（FMDV）是严重危害畜牧业健康发展的动物病毒，而劫持宿主翻译系统实现自身mRNA优先翻译则是病毒建立胞内感染的关键步骤和限速环节，但其翻译调控机制尚不明确。近期，本团队发表于《Journal of Virology》的文章通过RNA亲和捕捉法和RNA免疫共沉淀技术，结合互作组学分析和基因敲除等方法，系统解析了DDX5调控FMDV-IRES依赖性翻译和基因组复制的分子机制，为深入理解病毒突破宿主翻译限制的调控网络，以及开发靶向病毒-宿主互作的新型抗病毒策略提供了理论依据。
文章摘要
内部核糖体进入位点（IRES）是许多病毒mRNA中的一种顺式作用结构元件，通过招募多种RNA结合蛋白及IRES反式作用因子（ITAFs）介导非帽依赖性翻译。口蹄疫病毒（FMDV）作为小核糖核酸病毒科的重要成员，其基因组包含功能性IRES元件，在病毒蛋白翻译与RNA合成中发挥关键作用。本研究揭示了一种此前未知的调控机制：DEAD-box RNA解旋酶5（DDX5）作为新型ITAF，通过两种独立策略抑制口蹄疫病毒的翻译与RNA合成。首先，DDX5结合IRES的D4结构域，通过阻断80S核糖体组装抑制IRES驱动的病毒翻译；其次，DDX5与病毒RNA依赖性RNA聚合酶3Dpol及病毒3′UTR相互作用，破坏病毒RNA合成过程。有趣的是，病毒前体蛋白3ABCD通过3Cpro介导的蛋白酶解作用可拮抗DDX5的抑制功能。体内实验进一步证实了DDX5在口蹄疫病毒致病机制中的关键作用。这些发现深化了我们对病毒如何利用或拮抗宿主因子调控IRES驱动翻译的理解，为病毒感染过程中的翻译控制机制提供了新视角。
结果展示
1.DDX5参与FMDV增殖
通过PK-15细胞感染FMDV发现，DDX5在mRNA水平上调但蛋白表达下降。敲低DDX5后，病毒RNA、结构蛋白及病毒滴度均显著升高，但不影响组装与释放，表明DDX5在FMDV复制过程中可能起到限制性作用(图1)。
图1 DDX5参与FMDV增殖
2.DDX5负向调控FMDV增殖
利用CRISPR-Cas9技术构建DDX5敲除细胞系，发现DDX5缺失显著促进FMDV增殖，而过表达则抑制病毒复制。通过截短突变体功能分析，发现全长DDX5具有抑制FMDV复制的完整能力，而仅包含N端DEAD盒、C端解旋酶结构域或P68HR区域的结构均无法单独发挥作用，表明DDX5是FMDV复制的关键负调控因子，其完整结构对其抗病毒功能至关重要(图2)。
图2 DDX5对FMDV的复制和增殖具有抑制作用
3.DDX5抑制FMDV-IRES依赖性翻译
通过转染FMDV亚基因组复制子RNA，发现DDX5敲除促进EGFP表达，而过表达DDX5则抑制复制子活性，提示DDX5影响FMDV的翻译和/或复制。利用双荧光素酶报告系统进一步证实，DDX5能特异性抑制FMDV和EMCV的 IRES翻译，但对PV（I型）、CSFV（III型）和SVA（IV型）的IRES无影响。结果表明DDX5是FMDV IRES翻译的负调控因子(图3)。
图3 DDX5是FMDV IRES翻译的负调控因子
4.分析DDX5与FMDV-IRES和3’UTR相互作用
通过RNA互作实验证实，DDX5可直接特异性结合FMDV RNA的IRES及3′UTR区域，其中IRES的D4结构域是关键结合区。此外，激光共聚焦实验显示FMDV感染可诱导DDX5在感染后期（6小时）从细胞核向细胞质转位。这些结果表明，DDX5通过与病毒RNA关键区域直接互作，并在感染后发生亚细胞重定位，从而可能参与对病毒复制的调控(图4)。
图 4 DDX5与FMDV-IRES和3’UTR相互作用
5.DDX5不直接调控FMDV mRNA翻译起始
通过蔗糖密度梯度离心分析，发现FMDV感染会破坏宿主细胞的全局翻译，诱导DDX5部分结合至40S核糖体亚基。并与eIF4G、PABP等翻译起始因子互作，提示其可能参与调控FMDV IRES介导的翻译起始。然而，DDX5敲低并不影响IRES对eIF2α、eIF3e等关键因子的招募，表明其不参与翻译起始复合物的核心组装，而更可能作为调节因子，在后续步骤（如60S亚基的加入）中发挥作用，从而干扰功能性80S核糖体的形成(图5)。
图 5 DDX5不影响FMDV IRES对关键起始因子的招募
6.DDX5干扰FMDV-IRES上的80S核糖体组装
通过多聚核糖体图谱分析发现DDX5抑制FMDV IRES依赖性翻译。敲除DDX5使病毒mRNA向多聚核糖体区偏移并增加其丰度，而过表达则相反，表明DDX5特异性抑制病毒翻译。体外实验证实重组DDX5蛋白能直接抑制80S核糖体组装。上述结果表明，DDX5通过阻断60S亚基与43S前起始复合物的结合，抑制功能性80S核糖体形成，从而负调控FMDV IRES翻译(图6)。
图 6 DDX5不影响FMDV IRES对关键起始因子的招募
7、DDX5通过与口蹄疫病毒3D聚合酶相互作用抑制病毒RNA合成
使用CHX分离翻译和RNA合成过程发现，DDX5敲除能直接增强FMDV RNA水平。DDX5可与病毒聚合酶3Dpol直接互作并共定位，其互作由病毒感染或3Dpro诱导。为排除DDX5对IRES翻译的潜在影响，构建了帽依赖性翻译但复制缺陷的rFMDV-mCherry质粒，以及IRES突变但复制能力完整的rFMDV-EGFP复制子，结果表明，在抑制新蛋白合成后，DDX5敲除仍能显著促进复制子RNA的积累(图7)。
图 7 DDX5与3Dpol互作抑制FMDV的RNA合成
8、口蹄疫病毒通过3ABCD蛋白酶前体拮抗DDX5介导的抑制
FMDV通过其前体蛋白3ABCD中的3C蛋白酶，特异性切割宿主DDX5蛋白第123位的谷氨酰胺（Gln-123），从而破坏其完整结构。该切割不被经典蛋白酶体、溶酶体或凋亡途径抑制剂所抑制。切割产生的N端或C端片段均丧失抗病毒活性，证明该切割有效拮抗了DDX5对病毒复制的限制作用(图8)。
图 8 口蹄疫病毒通过3ABCD蛋白酶前体拮抗DDX5介导的抑制
9、DDX5敲降增强了小鼠对FMDV感染的易感性
在乳鼠体内利用腺病毒载体敲低DDX5表达，探究其在FMDV感染中的功能。结果显示，与对照相比，DDX5敲低组小鼠的多个组织DDX5蛋白水平显著下降。在FMDV攻毒后，敲低组小鼠全部在4天内死亡，而对照组在6天内全部死亡。同时，敲低组肌肉组织的病毒载量较对照组高出约10^2.1倍。这些结果表明，DDX5的敲低增强了乳鼠对FMDV的易感性(图9)。
图 9 DDX5敲降增强了小鼠对FMDV感染的易感性
全文总结及科学意义
研究结论与意义：
本研究系统阐明了DDX5在口蹄疫病毒（FMDV）感染中的双重作用与病毒拮抗机制。DDX5通过直接结合病毒IRES（尤其是D4区）和3′UTR，抑制IRES介导的翻译（阻断80S核糖体组装）及病毒RNA合成（与3Dpol互作），从而负调控病毒复制。然而，FMDV通过其前体蛋白3ABCD中的3C蛋白酶切割DDX5第123位氨基酸，使其失活以拮抗宿主限制(见下图)。体内实验证实，敲低DDX5会加剧乳鼠的病毒感染与致死率。总之，这些发现加深了对病毒如何利用或拮抗细胞因子来调节IRES驱动的翻译的理解，并为病毒感染期间的翻译控制提供了新的见解 。
该研究得到了甘肃省科技计划项目（25JRRA1086、25JRA1089、24JRA804）和宁夏省重点研发计划项目（2024BF02017）的支持。的资助。郭慧琛研究员为论文通讯作者，博士研究生吴金恩为第一作者。
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