同月，慈安太后、慈禧太后联合恭亲王奕䜣发动“辛酉政变”，处置了“顾命八大臣”，夺取了最高政权。咸丰十一年（1861年）十一月，同治帝奉两宫皇太后前往养心殿，举行垂帘听政大典。奕䜣任议政王、军机大臣，管理总理各国事务衙门事务，集内政外交大权于一身，成为统治集团的核心人物。此后，持续二十年的“二宫垂帘，亲王议政”的格局正式形成。在此期间，清政府暂时进入平静时期，史称“同治中兴”。
慈禧太后随着地位的稳固，她和奕䜣之间争夺权夺利的矛盾日益尖锐。同治四年（1865年）发生了“蔡寿祺事件”，慈禧太后趁机免去奕䜣的议政王一职，奕䜣的权力被大大地削弱。同治八年（1869年）七月，慈禧太后的心腹太监安德海违反祖制，擅出宫禁，在未携带任何公文的情况下借机敛财。山东巡抚丁宝桢将安德海一行扣留，急速派人至京师请旨。慈禧太后闻讯之下，惶骇无措。慈安太后召奕䜣等人议之，决定将安德海就地诛杀。慈禧太后对慈安太后与奕䜣的处置举措深为不满，两宫太后之间因此芥蒂日深。
同治十一年（1872年）秋，同治帝已十七岁，理应册立皇后。在皇后人选的问题上，慈安太后倾向于户部尚书崇绮之女，慈禧太后则执意立员外郎凤秀之女，同治帝同意慈安太后的意见，立崇绮之女阿鲁特氏为皇后，选凤秀之女沙济富察氏为慧妃。亲生儿子不听自己的话，而听命慈安太后，慈禧太后十分生气。因此在同治帝婚后反复告诫，并命太监对皇帝的行踪予以监视。这种粗暴干预，同治帝非常苦恼，使得他日益疏远慈禧太后。
同治十三年（1874年）十一月，同治帝染病，御医诊断为天花。在慈禧太后的授意下，所有内外各衙门陈奏事件，由她批览裁定。十二月初五日，同治帝病逝。慈安太后、慈禧太后选择醇亲王奕譞之子载湉（慈禧太后妹妹的儿子）继位，为光绪帝，再度垂帘训政。光绪七年（1881年）三月，慈安太后病逝。从此，慈禧太后总揽统治大权达三十年。
光绪十五年（1889年）二月，慈禧太后撤帘归政。朝内一切用人行政，仍出慈禧太后之手。因甲午战争大败，光绪二十四年（1898年）四月，光绪帝发出“明定国是”的上谕，开展运动。八月初四日，慈禧太后令人将光绪帝送往瀛台。从此，光绪帝失去了人身自由。初六日，慈禧太后发布上谕，由自己再行训政。
光绪九年（1883年）十二月，中法战争爆发。战争期间，清军接连受挫。次年三月，慈禧太后以奕䜣“因循委靡，决难振作”为借口，免去他的一切职务，撤去恩加双俸，史称“甲申易枢”。光绪十一年（1885年）二月，清军大败法军于镇南关（今友谊关）。慈禧太后决意趁机求和，下令撤军，签订了《中法新约》。
光绪十一年（1885年）九月，清廷成立海军衙门，以醇亲王奕譞总理海军事务。禀承慈禧太后的意旨，以办海军的名义，修葺被英法联军焚毁的清漪园，后改名颐和园。随着光绪帝长大成人，慈禧太后的权力受到威胁。光绪十四年（1888年）十月，她擅自将胞弟桂祥之女静芬，指立为光绪帝的皇后。侍郎长叙的两个女儿同时入选，封为瑾嫔，珍嫔。次年正月，大婚礼成。为对慈禧太后包办婚事的抗争，光绪帝藉口有病，撤销了宴请那拉氏家族的盛会。母子不和导致了夫妻反目，困扰晚清宫廷的帝后党争，已种下了根苗。
光绪二十年（1894年）六月，中日甲午战争爆发，北洋海军全军覆没，被迫签订了丧权辱国的《马关条约》。光绪二十三年（1897年）十月，德国出兵强占胶州湾，俄国强行租借旅顺大连湾，其他列强也纷纷要求割地。征得慈禧太后同意后，光绪二十四年（1898年）四月，光绪帝发布了《明定国是诏》，以变法自强。因变法损害了以慈禧太后为首的守旧派利益而遭到抵制。九月，慈禧太后发动戊戌政变，光绪帝被囚，变法失败。
光绪二十六年（1900年）春，以英国为首的八国联军发动侵华战争。十二月，慈禧太后表示要“量中华之物力，结与国之欢心，签订了丧权辱国的《辛丑条约》。条约规定赔款白银4.5亿两，割让台湾，允许外国军队驻扎京津要地，中国自此彻底沦为半殖民地半封建社会。期间，俄军占领中国东北并胁迫签订《奉天交地暂且章程》，掠夺资源。
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