Mol Cell | 史俊炜/谭凯等开发优化的CRISPR功能基因组学平台用于急性髓系白恤病治疗靶点的筛选|crispr|史俊炜|基因组学平台|细胞系|谭凯|靶点

急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是一种高度恶性的血液癌症，具有未分化，异质性强且容易复发的特点。近些年多项针对AML进行的CRISPR基因筛选鉴定出大量AML特异性靶点【1-4】，但针对这些靶点的药物在临床试验中效果欠佳【5】。其中一部分原因是这些筛选都是在细胞系模型或者小鼠模型上进行的，但这些模型并不能完全代表疾病本身。原代AML细胞虽然会是更贴近疾病本身的模型，但原代细胞难培养，病毒感染效率低，CRISPR敲除效率低，这些都导致了目前没有成功在原代AML细胞实现CRISPR筛选的报道。

2026年2月26日，宾夕法尼亚大学医学院史俊炜教授，费城儿童医院谭凯教授和 Kathrin M. Bernt 教授合作（史俊炜教授实验室博士研究生曹镇东和博士后研究员于思翔为共同第一作者）在Molecular Cell上发表了文章

CRISPR-based functional genomics for dissecting therapeutic dependency in primary acute myeloid leukemia samples

，文章对基于 CRISPR 基因编辑的功能基因组学（functional genomics）平台进行了优化，从而使其首次应用于原代急性髓系白血病样本。作者进一步通过传统CRISPR筛选和扰动测序（Perturb-Seq）技术，在原代AML样本中鉴定出潜在治疗靶点，并系统揭示了其细胞异质性。

研究人员首先对已有的CRISPR筛选平台做出了如下改进：1，将sgRNA或Cas9慢病毒载体上的抗生素抗性基因替换为荧光标签，以避免抗生素筛选过程中对原代细胞异质性的影响；2，在Cas9慢病毒载体中引入更强的SFFV启动子，增加Cas9蛋白的表达水平；3，改进sgRNA载体，使其稳定性增加【6】；4，使用Retronctin包被的平板【7】，并将浓缩的慢病毒富集在其表面，从而提高慢病毒的转导效率。

为了验证以上改进能否达到在原代AML样品中进行CRISPR筛选的标准，研究人员选择细胞表面蛋白CD33和CD44作为靶点。在22个原代病人样本中，作者成功对其中19个原代样本实现了单基因敲除。结合Cas9蛋白/sgRNA双阳性率和表面蛋白的敲除效率，16个原代样本可以进行CRISPR基因筛选，比例达到73%（16/22）。

在证明了优化的CRISPR平台在原代AML样品中的有效性后，研究人员继而进行了以下3 种筛选：1，传统CRISPR基因敲除筛选，以找出不同突变背景的原代AML细胞各自不同的“依赖基因”；2，CRISPRi基因干扰筛选，以找出原代AML细胞中发挥重要功能的顺式作用元件；3，Perturb-seq扰动测序，利用更少量的细胞，找到影响AML生长的关键因子，同时可以看到关键因子是如何影响细胞分化状态变化，细胞周期变化，转录组变化和不同亚群组成变化。

值得一提的是，在传统CRISPR基因敲除筛选中，研究人员发现了不同突变背景的原代AML细胞对SETDB1和EP300敲除的反应有很大不同。SETDB1和EP300被普遍认为在AML细胞系中起到致癌驱动基因的作用【8,9】。但在原代细胞的筛选中，靶向EP300的sgRNA在MLL融合的亚型中减少，在IDH1或IDH2突变亚型中富集；相类似的是，靶向SETDB1的sgRNA在IDH1突变亚型中富集，在其他亚型中减少。这些结果表明，不同的突变背景会是细胞对完全不同的基因产生依赖，凸显了在原代AML样品上进行CRISPR筛选和靶点验证的必要性。

随后，研究人员将优化的CRISPR平台扩展到CRISPRi基因干扰筛选以找到重要的顺式作用元件。团队选取了PDX（Patient-Derived Xenograft，PDX）。这个PDX模型来源于一位被确诊为B细胞急性淋巴细胞白血病（ B-cell acute lymphoblastic ，B-ALL）的病人在接受了B细胞靶向疗法后，肿瘤细胞经历了细胞谱系转换，转变为急性髓系白血病 AML【10】。通过对比复发AML与原始B-ALL的单细胞测序数据，研究确立了44个候选基因，并设计了针对其启动子和增强子的 CRISPR文库进行筛选。实验不仅证实了 MYC 增强子模块（ME1–ME5）对细胞增殖的关键作用，还鉴定出位于转录因子MYB的内含子区域的增强子（MYB_ATAC ）。

最后，研究人员利用Perturb-seq扰动测序技术，在多种突变背景的原代AML病人样品中系统解析了与白血病维持相关基因的功能。结果表明，不同基因扰动可引起关键转录程序的变化，包括 HOXA 基因簇表达、MYC/MYB 调控、髓系分化标志物以及内源性逆转录病毒（ERV）激活。通过整合细胞数量变化、细胞周期组成以及白血病相关基因特征分析，研究发现 S 期细胞比例下降和增殖相关通路变化能够预测基因必需性，为传统 CRISPR筛选提供了替代或补充方法。进一步将 Perturb-seq 数据投射到正常造血分化轨迹上，揭示了不同基因扰动对 AML 细胞状态及亚群组成的影响。

综上所述，研究人员开发了一个优化的CRISPR功能基因组学平台，首次在原代AML病人样本中进行CRISPR筛选。这些筛选不仅验证了已知的AML靶点，鉴定出了新的顺式作用关键，更重要的是，揭示了在原代AML病人样本中不同突变背景导致的完全不同的癌症依赖性和细胞异质性。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.02.003

制版人：十一

参考文献

1. Tzelepis, K. et al. A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.Cell Reports17 , 1193-1205 (2016).

2. Yamauchi, T. et al. Genome-wide CRISPR-Cas9 Screen Identifies Leukemia-Specific Dependence on a Pre-mRNA Metabolic Pathway Regulated by DCPS.Cancer Cell33 , 386-+ (2018).

3. Lu, B. et al. A Transcription Factor Addiction in Leukemia Imposed by the MLL Promoter Sequence.Cancer Cell34 , 970-+ (2018).

4. Cao, Z.D. et al. ZMYND8-regulated IRF8 transcription axis is an acute myeloid leukemia dependency.Mol Cell81 , 3604-+ (2021).

5. Kayser, S. & Levis, M.J. The clinical impact of the molecular landscape of acute myeloid leukemia.Haematologica108 , 308-320 (2023).

6. Jaitin, D.A. et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.Cell167 , 1883-+ (2016).

7. Hanenberg, H. et al. Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells.Nat Med2 , 876-882 (1996).

8. Cuellar, T.L. et al. Silencing of retrotransposons by SETDB1 inhibits the interferon response in acute myeloid leukemia.Journal of Cell Biology216 , 3535-3549 (2017).

9. Giotopoulos, G. et al. The epigenetic regulators CBP and p300 facilitate leukemogenesis and represent therapeutic targets in acute myeloid leukemia.Oncogene35 , 279-289 (2016).

10. Chen, C.Y. et al. Single-cell multiomics reveals increased plasticity, resistant populations, and stem-cell-like blasts in KMT2A-rearranged leukemia.Blood139 , 2198-2211 (2022).

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