今天分享一篇在著名期刊Phytomedicine上,广州中医药大学第三附属医院中医药防治骨质疏松症研究广州重点实验室\广州中医药大学广东中草药囊泡工程研究中心等团队发表“Epimedium brevicornu Maxim.-derived extracellular vesicle-like particles stimulate VEGF-mediated angiogenesis to alleviate postmenopausal osteoporosis”的研究论文。
简短版
绝经后骨质疏松症（PMOP）是一种可引发脆性骨折的骨骼疾病，影响全球数百万绝经后女性。淫羊藿（EpimediumbrevicornuMaxim.，EP）具有抗骨质疏松潜力，但其活性成分与作用机制尚不明确。淫羊藿源胞外囊泡样颗粒（EPEVLPs）是天然存在的生物活性组分，目前尚无研究全面阐明EPEVLPs在PMOP中的双重调控作用。目的：探究EPEVLPs对绝经后骨质疏松症的骨靶向能力与治疗效果。方法：采用差速超速离心法从新鲜淫羊藿叶片中分离EPEVLPs，并通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、SDSPAGE、琼脂糖凝胶电泳、薄层色谱、高效液相色谱进行系统表征。在绝经后骨质疏松模型体内评估骨靶向特异性、抗骨质疏松活性与生物相容性。体外实验包括：（1）通过免疫组化染色与RTqPCR评估人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）与MC3T3细胞的成骨分化；（2）通过CCK8与流式细胞术检测人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖与凋亡；（3）通过生物信息学分析、划痕愈合、Transwell迁移、管形成实验与ELISA评估血管生成潜能。结果：从淫羊藿中分离得到杯状双层纳米结构的EPEVLPs，包含核酸、蛋白质、脂质、淫羊藿次苷C及关键抗骨质疏松化合物（淫羊藿苷）。体内实验显示其优先富集于骨质疏松股骨，有效减轻骨丢失且无肝肾毒性。机制上，EPEVLPs以剂量依赖性方式上调血管内皮生长因子（VEGF）表达，增强HUVECs增殖、迁移与管形成。这种由血管生成驱动的骨血管微环境重塑与骨稳态恢复相关。结论：本研究证实EPEVLPs通过淫羊藿苷介导激活VEGF依赖性血管生成，从而改善绝经后骨质疏松症。该植物源纳米平台通过血管再生偶联成骨作用恢复骨稳态，为靶向治疗提供了具有转化前景的新策略。
详细版
绝经后骨质疏松症（PMOP）是一种以绝经后雌激素急剧下降导致骨量减少为特征的全身性骨骼疾病。随着女性年龄增长，骨丢失呈渐进性、隐匿性发生，导致骨密度与骨强度下降、脆性增加、骨折风险升高，进而降低预期寿命。目前骨质疏松的药物治疗包括双膦酸盐、雷洛昔芬、降钙素、雌激素、地诺单抗与合成代谢药物（ArceoMendoza&Camacho，2021）。然而，颌骨坏死、骨转换抑制引发的非典型股骨骨折、心房颤动等不良反应限制了这些药物的长期使用。此外，雌激素替代治疗会升高静脉血栓栓塞等不良事件风险。综上，亟需开发天然、安全的骨质疏松干预手段。
植物源胞外囊泡样颗粒（PEVLPs）是从天然植物中分离的囊泡样纳米颗粒，因其来源丰富、免疫原性低、活性显著等优势受到广泛关注。PEVLPs天然富含蛋白质、脂质、RNA等生物活性分子，其优异的生物相容性、组织穿透性与理化稳定性使其可作为生物治疗剂与药物递送系统。此外，PEVLPs可实现精准递送，改善活性成分生物利用度不足的问题并提升生物安全性。研究表明，人参源胞外囊泡样颗粒（GEVLPs）可与切除的自体肿瘤细胞膜杂交形成功能化杂交囊泡（HMNPs）并用作疫苗，通过HMNPs免疫可降低术后肿瘤复发与转移风险，同时保持良好生物相容性。本团队前期两项研究发现，骨碎补（RD）与巴戟天（MO）源胞外囊泡样颗粒均表现出良好的骨组织靶向活性与抗骨质疏松作用，可逆转骨质疏松。此外，山药源EVLPs经小鼠口服给药可促进骨再生且具有良好的全身生物安全性。
淫羊藿（EpimediumbrevicornuMaxim.，EP），俗称仙灵脾，为小檗科多年生草本植物，其干燥地上部分入药。作为中医药数千年来的核心药材，淫羊藿因“补肾益精、强筋健骨”的传统功效被广泛用于PMOP治疗。现代药理研究已鉴定其生物活性成分，包括主要黄酮类成分淫羊藿苷、黄酮、木脂素、生物碱与挥发油。值得注意的是，新兴研究聚焦于阐明淫羊藿抗骨质疏松活性的分子机制，尤其是淫羊藿苷及相关化合物介导的破骨细胞抑制与成骨细胞激活。
本研究从新鲜淫羊藿叶片中分离纯化高产量的淫羊藿源胞外囊泡样颗粒（EPEVLPs），并从生物活性成分新角度探究其作用机制，阐明淫羊藿的抗骨质疏松效应。
1.EPEVLPs的理化表征
EPEVLPs呈现典型的杯状双层膜结构形态特征（图1A），粒径分布在50–150nm之间（图1B）。如图1C所示，EPEVLPs对TritonX100浓度升高呈浓度依赖性响应，当TritonX100浓度升至0.1%时，颗粒浓度低于10%，表明EPEVLPs纯度高于90%。EPEVLPs主要包含小分子量RNA、小分子量蛋白（10–35kDa）与多种脂质（图1D–F），提示其可能通过RNA、蛋白与脂质组分参与细胞间通讯并介导生物学过程。样品色谱图中出现两个特征峰（图1G），与淫羊藿次苷C（图1H）、淫羊藿苷（图1I）标准品比对后，确认这两个特征峰分别对应淫羊藿次苷C与淫羊藿苷。此外，通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）对EPEVLPs进行表征（主峰154nm），并通过小RNA测序鉴定出146个miRNA。代谢组学分析进一步揭示了多类代谢物（补充图S5）。
2.EPEVLPs的体内分布与生物安全性
如图2A–B所示，游离DiR染料与DiR标记的EPEVLPs均逐渐在肝、脾、肺组织富集。静脉给药后，DiR与EPEVLPs在12h于肝、脾、肺中富集量最高，24h与48h逐渐下降；而灌胃给药后，其在肝、脾、肺中的荧光强度随时间无明显变化。值得注意的是，两种给药途径下，股骨处荧光强度均随时间升高，提示EPEVLPs可进入体循环（即使口服给药）并在股骨部位富集。如图2C–F所示，EPEVLPs组与对照组血清ALT、AST、BUN、Crea水平无显著差异（p>0.05）。HE染色显示，对照组与EPEVLPs组主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）均无病理性损伤（图2G），表明EPEVLPs具有良好的生物安全性。
3.EPEVLPs改善去卵巢小鼠骨质疏松
与假手术组相比，OVX组小鼠右侧股骨显微CT分析显示股骨远端骨小梁结构显著破坏（图3A），提示EPEVLPs对PMOP具有治疗潜力。定量分析显示（图3B），OVX组BMD、BV、BV/TV（%）、Tb.N显著低于假手术组（p<0.01），而SMI、Tb.Sp显著高于假手术组（p<0.01），证实OVX模型构建成功。值得注意的是，高剂量EPEVLPs显著逆转去卵巢诱导的骨小梁结构紊乱（图3A）；与未处理OVX对照组相比，EPEVLPs给药显著减轻骨丢失，表现为BMD、BV、BV/TV、Tb.N升高（p<0.05），SMI、Tb.Sp降低（p<0.05）。低剂量EPEVLPs对绝经后小鼠骨质疏松疗效有限，仅使BMD小幅提升（6.74%，p<0.05），BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Sp、SMI等关键微观结构指标无显著改善（与OVX组相比均p>0.05），因此后续组织学分析（图3C–F）仅聚焦高剂量组，探究骨再生的潜在机制。免疫组化分析显示，与OVX组相比，EPEVLPs处理显著升高骨组织中ALP与OCN表达（p<0.05；图3C–F）。
4.EPEVLPs体外不直接促进成骨
补充图S1A–B显示，当浓度不高于1×10¹⁰particles/mL时无细胞毒性，且EPEVLPs既不促进也不抑制hBMSCs与MC3T3E1细胞增殖。茜素红染色显示，EPEVLPs处理未增加hBMSCs或MC3T3E1细胞的钙沉积（补充图S1C）。RUNX2、OCN、BMP2是成骨分化过程中的关键成骨细胞标志物，基因表达分析显示，EPEVLPs处理后hBMSCs与MC3T3E1细胞中RUNX2、OCN、BMP2基因水平稳定（补充图S1D–I）。以上结果提示EPEVLPs不直接促进成骨细胞增殖与分化，其抗骨质疏松作用可能通过其他途径介导。
5.EPEVLPs的代谢组学与网络药理学关联分析
为探究EPEVLPs治疗骨质疏松的作用机制，本研究结合代谢组学与网络药理学构建药物成分
疾病靶点整合网络，随后通过分子对接、分子动力学模拟、表面等离子体共振（SPR）评估药物成分与靶点蛋白的结合亲和力与稳定性。在EPEVLPs与淫羊藿中共同鉴定出11种活性成分：淫羊藿次苷C、淫羊藿苷、箭藿苷A、淫羊藿苷A、淫羊藿定C、淫羊藿定B、胡薄荷酮、甲基丁香酚、酪醇、仙灵藿苷D、己糖苷E（图4A）。代谢组学数据显示，箭藿苷A、淫羊藿苷、淫羊藿定B、淫羊藿次苷C是EPEVLPs中11种共有成分中含量最高的四种（图4B）。此外，淫羊藿苷与淫羊藿次苷C的101个靶点基因与骨质疏松相关（图4C）。KEGG通路富集分析显示，这些靶点基因显著富集于VEGF信号通路（图4D）。网络分析表明，EPEVLPs与淫羊藿中的多数共有成分与骨质疏松核心信号靶点相关（图4E）。PPI网络分析进一步确定VEGFR（VEGF受体）是骨质疏松相关信号通路中的关键蛋白（图4F）。分子对接显示，仙灵藿苷D、淫羊藿定B、箭藿苷A、淫羊藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿苷A的结合活性优于其他EPEVLPs成分（结合能<−8.2kcal/mol）（图4G，补充图S2）。淫羊藿苷作为淫羊藿的主要黄酮活性成分，在EPEVLPs代谢组学分析中平均表达量位居第二，且广泛用于骨相关疾病治疗（Si等，2024；Zhang等，2022），同时被《中国药典》列为质量控制标准，因此选择淫羊藿苷作为目标生物活性分子开展研究。分子动力学模拟显示淫羊藿苷与VEGFR2结合稳定，提示其潜在生物活性（补充图S3）。SPR证实淫羊藿苷与VEGFR2受体特异性结合（KD=2.47e−4M），验证其对VEGF通路的靶向作用（图4H）。
6.EPEVLPs对HUVECs的细胞毒性及体外/体内内化
凋亡与CCK8实验评估细胞毒性显示，EPEVLPs在浓度低于1×10¹²particles/mL时对HUVECs无显著凋亡诱导作用，生物安全性优异（图5A）。CCK8实验显示，EPEVLPs对HUVECs具有剂量依赖性增殖作用，但浓度达1×10¹²particles/mL时细胞活力显著下降（图5B）。
为验证细胞摄取，将DiI标记的EPEVLPs与HUVECs共孵育8h，流式细胞术显示各浓度组内化率均>90%（图5C）。荧光显微镜观察（图5D–E）显示，DiI标记的EPEVLPs（红色）随时间在细胞质中累积，4h后出现大量内化，提示起效迅速。
同时探究EPEVLPs对体内血管内皮细胞的影响，DiI标记EPEVLPs组小鼠肝、肾、腹主动脉、股骨组织均出现较强荧光信号（补充图S4A）；腹主动脉组织切片共聚焦图像中观察到EPEVLPs（红色）与血管内皮细胞（绿色）共定位（白色箭头）（图5F–G）。
7.EPEVLPs对血管生成的影响
为探究EPEVLPs对HUVECs迁移的影响，开展划痕愈合与Transwell迁移实验。如图6A–B所示，EPEVLPs处理的内皮细胞划痕愈合增强，24h愈合率约30%–50%，显著高于正常对照组（p<0.01）。Transwell实验证实EPEVLPs显著促进HUVECs迁移（补充图S4B）。内皮细胞黏附、融合与管状结构形成是血管生成的关键环节，因此基于Matrigel的管形成实验显示，与对照组相比，EPEVLPs在3、6、12h显著加速HUVECs管状网络形成（图6C）；累积管长定量分析显示，各时间点EPEVLPs组管长均显著更长（图6D）。以上结果表明，EPEVLPs通过增强内皮细胞迁移与管形成促进早期血管生成。
CD31是评估血管生成的血管内皮标志物，通过免疫组化评估EPEVLPs对OVX小鼠股骨CD31表达的影响。EPEVLPs组CD31表达显著高于OVX组，OVX组显著低于假手术组（p<0.05，图6E–F）。综上，EPEVLPs可直接促进血管化，并通过增强血管生成发挥抗骨质疏松作用。
8.EPEVLPs通过VEGF信号通路促进血管生成
PCR与ELISA结果分析（图7A–B）显示，EPEVLPs显著上调HUVECs中VEGF的mRNA与蛋白水平。关键的是，加入临床获批的VEGF通路抑制剂贝伐珠单抗可有效抑制EPEVLPs诱导的VEGF上调，该抑制效应在蛋白水平较转录水平更显著（ELISA平均抑制率86%，PCR为27.69%）。以上结果共同表明，EPEVLPs主要通过激活VEGF信号通路促进血管生成，增强的血管化有助于改善骨微环境，最终缓解骨质疏松（图7C）。
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