脂质纳米颗粒核酸递送的六十年演变|介导|复合物|核酸|细胞|脂质|蛋白|阳离子

引言

1958年，Francis Crick提出了分子生物学的中心法则，指出遗传信息从DNA流向RNA再流向蛋白质。随后，Alexand及其同事发现高盐浓度可增强病毒RNA的低感染力，此后利用碱性蛋白和DEAE葡聚糖等转染方法显著提高了感染力。1973年，磷酸钙-DNA共沉淀法被证明能进一步提高纯化病毒DNA的感染力。随着重组DNA技术的发展，将钙磷酸盐和DEAE葡聚糖介导的转染方法应用于重组质粒在培养哺乳动物细胞中的递送和表达，促进了基因工程的发展。

早期关于体内基因递送的研究表明，注射含有病毒基因组的“裸”质粒可能导致感染。例如，1979年证实多瘤病毒质粒DNA在亲代给药后对小鼠和仓鼠具有感染性。然而，裸质粒基因递送方法的临床应用受到限制，归因于转染效率低下以及DNA随机自发整合入人类基因组等问题。与此同时，使用病毒载体的基因疗法常与免疫反应相关，这虽然对体细胞基因治疗不利，却促进了基于病毒载体的疫苗开发。核酸疫苗相比经典疫苗具有重要优势，其合成的蛋白质在细胞内被分解并通过MHC I类分子呈递，激活CD8+细胞毒性T细胞，从而刺激细胞免疫。

目前大多数正在开发的基因疗法使用病毒递送系统，如腺相关病毒载体，但其在遗传容量、免疫原性和制造方面面临阻碍。相比之下，非病毒脂质基递送系统如脂质纳米颗粒，因其在安全性、耐受性、可重复给药、大遗传载荷、易于设计和制造等方面的优势，可能会成为主导。

一、脂质体与脂质复合物的早期研究

1. 脂质体的发现与表征

1964年，人们发现卵磷脂在水性介质中的分散体产生了由同心脂质双层组成的多层系统，这支持了脂质在生物膜中提供渗透性屏障的提议。这一发现引发了表征脂质生物物理特性及其在膜中功能角色的密集研究。脂质体一词通常被理解为指代由脂质以双层结构组织而成的纳米或微米级颗粒的水性分散体。多种制剂方法被开发出来，包括1969年的超声处理、1973年的乙醇注入法、1979年的挤压法等，以产生不同大小和结构的脂质体。

早期致力于生成包含核酸的脂质体系统，始于1977年发现mRNA可被封装于通过乙醇制剂技术产生的脂质体中。1982年，使用非感染性重组质粒DNA的体内基因递送和表达得到证实，显示脂质体封装的含有大鼠前胰岛素原基因的pDNA在静脉给药后可在体内表达。然而，这些研究受到封装效率低、表达水平低和无法规模化制剂工艺的限制。例如，脂质体在水性介质中的捕获体积仅占总水性体积的一小部分，因此通过“被动”封装过程进行的DNA和mRNA封装效率很低。此外，带有负电荷表面的脂质体排斥带负电荷的核酸，也抑制了封装。

2. 阳离子脂质与脂质复合物的突破

1987年，Felgner假设带正电荷的脂质体可能提供一种增强带负电荷核酸聚合物封装效率的方法。基于脂质体研究的设计原则，合成了一系列阳离子脂质分子，其中N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTMA）是主要例子。当DOTMA与等摩尔水平的“辅助”脂质如DOPC或DOPE混合并分散在水性介质中时，会产生非常小、稳定、带正电荷的脂质体。当这些脂质体与pDNA混合时，可以形成大小和形态各异的“脂质复合物”。

脂质复合物的结构敏感于所用辅助脂质的相偏好。当辅助脂质为DOPC时，核酸似乎被夹在同心脂质双层之间。相反，当辅助脂质为DOPE时，低角X射线散射和电子显微镜显示核酸被包含在脂质以无序六角HII相形成的亲水管中。这种脂质复合物代表了相较于以往转染方案的重要封装进步，也是通过合理设计构建具有转染能力的纳米颗粒的潜在起点。

脂质复合物无需添加额外功能基团即可将pDNA和mRNA高效转染至培养细胞中。研究发现，在阳离子脂质体中掺入等摩尔水平的偏好HII相的脂质DOPE可提高转染效率，这与其在膜融合事件中的作用一致，可能与增强脂质复合物与内体膜之间的融合事件有关。相反，掺入偏好双层的脂质DOPC则抑制转染。如今，DOTMA–DOPE转染试剂在分子生物学实验室中得到广泛应用。

Vical公司致力于开发阳离子脂质制剂的体内基因递送应用。初步研究表征了脂质复合物DNA和mRNA直接注射入小鼠组织（包括肌肉）后的基因表达。骨骼肌中观察到高基因表达水平。值得注意的是，即使是不含阳离子脂质的“裸DNA”对照组，其基因表达水平也与含阳离子脂质的组相当。这一意外发现确立了Vical在裸DNA基因治疗和疫苗领域的领导地位。随后观察到的高转染水平被归因于压力诱导效应，使大分子能够通过肌肉细胞膜的暂时性破裂通过。

二、脂质纳米颗粒递送系统的演变

脂质纳米粒子系统的演变建立在对双层脂质体系统的理解之上，但也严重依赖于脂质多态性和脂质不对称性的基础研究，以及开发抗癌药物脂质体制剂的经验。

1. 脂质多态性与不对称性的启示

脂质多态性是指生物膜中很大比例的脂质在水性介质中优先采用非双层结构如六角HII相的有趣发现。1978年，Cullis和Hope提出非双层脂质在提供膜融合所需的中间结构中具有直接作用。2001年发现，将阳离子脂质与生物膜中发现的带负电荷的双层形成脂质混合会导致HII相结构的形成。这一发现与阳离子脂质破坏生物膜中双层结构以实现核酸货物细胞内递送的能力一致。

脂质不对称性研究也为LNP核酸递送系统的发展提供了必要的见解和工具。这些研究始于确定生物膜中观察到的脂质不对称跨双层分布的后果，并表明pH梯度可调节脂质囊泡中弱碱和弱酸脂质的跨双层分布。随后的工作集中在理解影响双层囊泡系统间膜融合的因素，显示可离子化阳离子脂质的掺入可响应pH梯度产生脂质不对称性。此外，PEG脂质对膜融合的影响研究表明，短链（C14）PEG脂质可从囊泡解离从而允许融合进行。这些概念对于开发有效的LNP siRNA和mRNA递送系统至关重要。

2. 小分子药物脂质体制剂的经验

开发小分子药物脂质体制剂所获得的见解为设计基因治疗LNPs提供了重要指导。1986年，随着脂质体制备和载药的可扩展程序的开发，旨在更准确地将小分子递送至疾病部位的研究正式开始。挤压技术被证明适用于生产直径100 nm或更小的脂质体系统。随后发现了可扩展的pH“远程装载”技术用于将弱碱药物装载入脂质体。PEG涂层赋予脂质体系统长循环半衰期，使其能优先分布至肿瘤部位。这些工作导致FDA批准了十余种脂质体产品，主要含有抗癌药物。学到的主要教训是，脂质体系统必须小（直径<100 nm）、长循环，并由促进长循环半衰期的脂质组成。

3. 稳定化核酸脂质颗粒（SNALP）的开发

1990年代中期，Inex Pharmaceuticals和UBC的合作致力于开发脂质基核酸递送系统，使其在静脉注射后能表现出到达肿瘤等疾病部位所需的长循环半衰期。含有永久带正电荷阳离子脂质的脂质基系统因激活补体并被迅速清除而不理想。因此，努力转向开发在生理pH值下净中性电荷的递送系统。

1999年开发了第一个此类系统，称为稳定化质粒脂质颗粒（SPLP），使用少量阳离子脂质DODAC和PEG脂质通过洗涤剂透析法制备。PEG脂质的存在对于防止制剂过程中的聚集是必要的。静脉给药的SPLP显示出比复合物明显更长的循环寿命和更低毒性。随后的研究表明，含有短链PEG脂质的SPLP配方能调节其转染特性，这可能归因于其从脂质基系统解离的能力。

2001年，展示了利用最初为脂质不对称性研究开发的可离子化阳离子脂质DODAP，将反义寡核苷酸封装入脂质基系统（SALP）。研究表明，在pH值低于可离子化脂质pKa的条件下混合核酸聚合物与含有可离子化阳离子脂质的脂质体，它们应因可离子化脂质的正电荷而结合。随后利用T型管混合器进行乙醇中脂质与pH 4缓冲液中pDNA的快速混合，产生了小型带正电荷囊泡，随后与带负电荷DNA结合，实现了无需挤压的可扩展方法。

为了增强脂质载体与内体膜融合的可能性，利用阳离子脂质与内源性阴离子脂质结合诱导膜破坏性HII相的观察，设计了可离子化阳离子脂质DLinDMA。在此基础上，Protiva与Alnylam合作，将设计用于沉默ApoB的siRNA封装入称为稳定化核酸脂质粒子（SNALP）的SALP版本中。尽管观察到小鼠和非人灵长类动物中ApoB的减少，但配方的效力或治疗指数不足以进行临床开发。

4. LNP技术的优化与临床转化

2010年，报道了通过优化可离子化脂质成分的头基，可显著改善LNP siRNA配方的基因沉默效力。此时，SPLP、SALP和SNALP等配方被描述为LNPs家族的一部分。这些系统不能被称为脂质体，因为它们可表现出纳米结构的疏水内部。改善效力的理性假设是，当可离子化阳离子脂质在被摄取入肝细胞后的内体低pH环境中质子化时，它们与内源性阴离子脂质结合，通过形成膜破坏性非双层中间体引发融合，从而使核酸释放进入细胞质。DLinKC2DMA被鉴定为更有效的可离子化脂质。2012年，DLinMC3DMA被鉴定为主要可离子化脂质，其pKa被证明是LNP活性的关键决定因素，最活跃的脂质表现出pKa为6.4。

次年，健康志愿者的I期临床试验显示，含有DLinMC3DMA和siRNA的LNP系统在肝脏中引起快速且强效的转甲状腺素蛋白下调。随后的III期临床试验在治疗转甲状腺素蛋白诱导的淀粉样变性方面取得了优异结果，导致FDA于2018年批准Onpattro。Onpattro现已给药部分患者长达10年，未报告因累积效应引起的不良事件。

值得注意的是，用于封装和递送siRNA的封装工艺和脂质成分也可应用于更大的RNA分子。2012年证明，为siRNA递送开发的LNP也可用于封装编码呼吸道合胞病毒F蛋白的自扩增RNA，并在小鼠肌肉注射后观察到强效且保护性的免疫反应。随后2015年研究表明，编码促红细胞生成素的mRNA可封装入LNP系统，静脉给药后在猪模型中导致循环中高水平促红细胞生成素

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三、LNP mRNA疫苗与治疗药物的影响

COVID-19 LNP mRNA疫苗具有改变世界的影响力，仅2021年就估计挽救了近1000万人的生命。这一影响力正被其他依赖LNP递送系统的RNA疗法的潜在临床应用日益超越。目前有超过60种使用LNP递送技术的疫苗和治疗药物已获批或正在临床开发中。