在哺乳动物中，性别决定依赖于性腺体细胞的分化，这些细胞营造出性别特异的环境，引导生殖细胞命运并确保生育能力。虽然遗传性别在受精时已确定，但生殖细胞最初保持未分化状态，在与性腺体细胞相互作用后才获得雄性或雌性身份。在体外重建这一过程，将为研究性别决定机制提供强大平台，并有望实现体外配子发生。然而，尽管在多能干细胞诱导原始生殖细胞样细胞方面取得进展，但功能性睾丸微环境的重建仍是一项重大挑战。
近日，《科学》杂志发表了由大阪大学和九州大学研究团队（通讯作者：吉野刚博士、林克彦博士）完成的研究论文《Reconstitution of sex determination and the testicular niche using mouse pluripotent stem cells》。该研究成功利用小鼠多能干细胞，通过模拟体内性别决定过程，重构了功能性睾丸体细胞，并最终在体外培育出能够产生健康后代的精子。
研究团队首先构建了携带性染色体特异性报告基因（睾丸标记Sox9-GFP和卵巢标记Foxl2-tdTomato）的小鼠胚胎干细胞系。通过精准调控BMP和WNT信号通路，他们成功诱导细胞经历双向潜能状态，并分化出睾丸支持细胞样细胞。这一过程严格依赖于Y染色体的存在，只有XY细胞才能生成SOX9阳性细胞，并自发组装成类似生精小管的管状结构，周围环绕着间质样细胞。
单细胞转录组分析揭示了这一体外分化轨迹与体内性别决定过程高度相似。在分化第6天，一个雄性特异性的细胞群体（c10）涌现出来，该群体富集了Sry、Sox9、Amh和Dmrt1等对支持细胞分化和功能至关重要的基因。相比之下，雌性分化路径则停留在另一细胞群体（c01），并表达Foxl2、Wnt4等卵巢相关基因。拟时序分析进一步描绘了支持细胞和基质细胞谱系的精确分化路径。
研究进一步将诱导得到的睾丸体细胞样细胞与同样由干细胞诱导的原始生殖细胞样细胞共培养，成功构建了睾丸类器官。在这个类器官中，原始生殖细胞样细胞展现出完整的雄性分化进程：依次分化为前精原细胞、精原细胞，并最终进入减数分裂，成为精母细胞。同时，类器官内也观察到了支持细胞、间质细胞和周肌样细胞的分化与正确组装，形成了功能性的睾丸微环境。
从这些睾丸类器官中，研究团队成功分离并建立了可无限增殖的生殖干细胞样细胞。将这些细胞移植到不育小鼠的睾丸中后，它们成功重建了精子发生过程，产生了形态完整、功能成熟的精子。通过单精子注射技术，这些精子使卵子受精，并最终获得了健康且可育的后代。这一结果在多个独立的细胞系中得到了验证，证明了系统的可靠性和高效性。
利用该培养系统，研究人员还揭示了性别决定的固有不对称性。当在诱导睾丸的条件下培养时，XX细胞无法产生SOX9阳性细胞，而是倾向于分化为FOXL2阳性细胞。反之，在诱导卵巢的条件下，XY细胞却能高效产生FOXL2阳性细胞，并且这些细胞具备支持卵子发生的能力。这表明，尽管睾丸分化严格依赖Y染色体，但卵巢分化程序在XY细胞中并未被完全封锁，揭示了雌雄性别决定通路根本性的不对称。
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