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（来源：小张聊科研）

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“A分子通过B通路调控C表型”是很多人国自然的一个常规写法，思路是A调控B通路；A调控C表型；文献报道B通路是C表型的重要通路，所以科学假说就是A通过B通路调控C表型……

这个说法作为科学“猜想”是可以的，但是作为“科学假说”是不严谨的。所以每年都会有很多这样的项目被毙掉，核心原因在于严谨性不足：假说只考虑了A通过B这条间接路径，但A直接调控C的可能性你排除了吗？B是必需的还是可有可无的？

因此，这类项目最大的问题在于申请人只看到了间接作用，完全没考虑直接作用的存在；只证明了一条通路存在，没证明它是必需的、更没评估它的贡献度。而评审专家想看到的申请人对间接和直接机制的判断和论证过程：特别是在排除直接作用（阴性结果）后的间接作用的必要性、重要性和其它可能性。如果这点没有考虑到，项目的科学假说就会被严重质疑，项目能拿到的希望就渺茫了。与此类似，高分文章中被审稿人质疑最多的也是这点，而这个问题的严重性足以让文章被拒稿。

为了更清晰的说明这个问题，下面举两个例子说明。

案例1：宏观层面调控的直接与间接作用

科学假说：某本子研究衰老如何驱动肺动脉高压。作者提出的假说是：衰老导致肠道梭菌属减少，进而减少代谢物β-羟基丁酸的生成；β-羟基丁酸通过血液循环抵达肺部，作用于肺血管平滑肌细胞（PASMC），通过一系列信号通路，最终驱动PASMC表型转化，促进肺动脉高压发生。

简单说就是：衰老→肠道菌群→代谢物→PASMC→肺动脉高压。一条长长的间接链条。

这个假说的问题在哪里？

作者只讲了这一条间接路径，但完全没有考虑：衰老本身能不能直接作用于PASMC？衰老可以直接导致PASMC的线粒体功能障碍、氧化应激积累、端粒缩短，而这些细胞自主性机制可以直接驱动PASMC表型转化，根本不需要肠道菌群参与。

这就是典型的“只考虑间接、忽略直接”。假说看似高大上，实则从一开始就偏了。因为作者没有问自己：如果衰老直接就能驱动PASMC表型转化，那我这条肠道菌群的间接路径还有多大意义？

评审提出的问题：

第一，衰老直接作用于PASMC的可能性你排除了吗？你的假说里完全没有考虑这条更直接的路径。

第二，你怎么证明肺动脉高压主要是通过这条间接路径，而不是直接路径？如果你清除肠道菌群，衰老相关的肺动脉高压表型是消失了、减弱了、还是没变化？如果只是部分减弱，那间接路径贡献了多少？直接路径贡献了多少？你的研究里没有设计这个实验。

第三，衰老同时影响着肠道菌群和肺血管。你观察到的“菌群变化”和“肺动脉高压”之间，很可能只是伴随关系，不是因果关系。因为衰老这个共同原因同时导致了这两个变化，它们之间不一定有直接的因果联系。

怎么让假说变严谨？如果要证明“衰老通过肠道菌群驱动肺动脉高压”，必须先评估“衰老直接驱动”的贡献。正确的验证顺序是：

第一步：做体外实验，将衰老的PASMC单独培养（脱离菌群和代谢物），看它是否发生表型转化。如果发生，说明存在直接作用。

第二步：比较直接作用和间接作用的强度。直接给衰老动物补充β-羟基丁酸，效果如何？清除菌群，效果如何？算出间接路径的贡献比例。

第三步：如果间接路径贡献很小，那这个假说就不值得作为核心机制来申请项目。

很多申请人跳过了第一步和第二步，直接讲间接路径，假说自然不严谨。

这个案例我们之前讲过，除了这个直接和间接的问题外，还有其它的问题，感兴趣的看这篇推文：国自然中用的最多研究思路4，这样就明白申请书为何拿不到了吧！

案例2 分子机制层面的直接和间接作用

科学假说：某本子研究A蛋白如何调控C基因的表达。作者发现：敲低A后，C基因表达显著下降；Co-IP证明A蛋白和B转录因子有相互作用；而B转录因子已知能结合C基因的启动子。于是作者得出结论：A蛋白通过结合B转录因子，促进B与C基因启动子的结合，从而激活C基因的转录。

这个假说的问题在哪里？

作者只讲了一条间接路径：A→B→C。但他完全没有考虑另一种可能性：A蛋白本身有没有可能直接结合C基因的启动子？B可能只是辅助因子，甚至不是必需的。

这就是典型的“只考虑间接、忽略直接”。假说看似完整，实则从一开始就偏了，因为作者没有问自己：如果A直接就能结合C启动子，那我这条A→B→C的间接路径还有多大意义？

评审提出的问题：

第一，Co-IP只证明A和B在同一个复合物里，但没证明A是否直接结合B。中间可能有蛋白C牵线搭桥，A并不直接接触B。

第二，最关键的问题：A到底是通过B来调控C，还是通过别的途径？作者没做rescue实验。敲低B后C表达下降，只能说明B是必需的，但不能证明A一定通过B。如果A直接结合C启动子，那B可能只是辅助。

第三，作者完全没有做ChIP-qPCR来检测A是否直接结合C基因启动子。这个实验不做，就无法排除直接作用，假说就不严谨。

怎么让假说变严谨？如果要证明“A通过B调控C”，必须先排除“A直接调控C”的可能性。正确的验证顺序是：

第一步：做ChIP-qPCR，检测A是否结合C基因启动子。如果结合，假说就要改成“A直接调控C，B可能辅助”。

第二步：如果不结合，再做Co-IP证明A和B相互作用。

第三步：做rescue实验：敲低B，回补B，看C表达是否恢复。证明功能上依赖B。

很多申请人跳过了第一步，直接讲间接路径，假说自然不严谨。

最后，以上两个案例说的是一个问题：直接与间接作用的必要性、重要性以及其它可能性。虽然宏观和微观层面不同，但核心是一个：申请人只看到了间接路径，完全忽略了直接路径的存在：假说从一开始就不完整，因为最直接、最简单的解释没有被排除。很多申请人的问题不是“实验做得不够”，而是“想得不够”。他们发现了一条间接路径，就觉得找到唯一可能性，完全没想过还有更直接的解释。

想让假说变得严谨，只需要在提出假说之前多问自己一句：有没有更直接的解释？我排除了吗？如果答案是“没想过”或“没排除”，那你的假说大概率会被评审揪出来。发现一条间接路径只是开始，排除直接路径才是关键。太复杂的调控轴和科学假说尽量要避免，因为大部分的申请人对于过长的调控轴很难把充分性和必要性论证清楚。

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