如果说现有的CRISPR单细胞筛选技术是“管中窥豹”，那么研究人员真正需要的，是一个能够同时看清基因表达、染色质状态和转录动态的多维窗口。单一模态的读出固然有价值，但细胞响应扰动的过程本质上是多层次的：转录因子活性变化、染色质重塑、基因表达程序的切换往往同步发生，割裂地分析任何一个维度都难以还原全貌。
2026年4月15日，The Rockefeller University的曹俊越与周伟团队（博士生许子涵为本文第一作者兼共同通讯作者）在Nature发表了文章Mapping convergent regulators of melanoma drug resistance by PerturbFate，推出了PerturbFate——一个将CRISPRi扰动与单细胞多组学检测深度整合的高通量筛选平台，首次在单细胞分辨率下同时捕获染色质可及性、新生RNA和稳态转录组，并以黑色素瘤耐药模型为示范，展示了该平台解析复杂细胞状态转变的强大能力。
近年来，以Perturb-seq为代表的CRISPR单细胞筛选技术深刻改变了基因功能研究的范式。然而，这类方法的核心局限始终存在：它们通常只能在一次实验中读取一种分子层次的信息，要么是基因表达，要么是染色质可及性，鱼与熊掌难以兼得。
这一限制在研究细胞状态转变时尤为棘手。细胞状态的维持与切换，本质上是转录因子、染色质结构和基因表达程序的协同运作——任何单一维度的快照都只是冰山一角。与此同时，现有平台的通量与成本也制约着筛选规模，难以在大规模基因集上开展系统性探索。
研究发现
一个细胞，三层信息，成本低于一分钱
PerturbFate的核心创新在于将代谢标记新生RNA（5-EU标记，捕获刚被转录出的RNA，反映实时转录活动）、染色质可及性检测（ATAC-seq，揭示基因组哪些区域处于“开放”状态）和稳态基因表达整合进同一套单细胞流程。依托单细胞组合索引（sci）技术，PerturbFate无需微流控设备，可在普通实验室条件下实现大规模并行检测，单细胞成本低于$0.01。研究团队通过一系列严格验证实验证明了各模态的检测质量：物种区分实验中单细胞纯度超过99%，新生RNA标记背景噪音低于0.4%，染色质信号在转录起始位点处呈现标准富集模式。此外，专门优化的双sgRNA载体设计显著提升了CRISPRi的敲降效率，使大规模筛选结果更为稳健可靠。
31万细胞，143个基因，一张完整的耐药调控地图
为展示PerturbFate的实际应用能力，研究团队选取黑色素瘤BRAFV600E突变细胞对维罗非尼（Vemurafenib，一种临床常用的BRAF抑制剂）耐药这一经典问题作为示范场景。在无药和药物处理两种条件下，团队对143个候选基因进行了系统扰动，最终分析超过31万个单细胞。通过整合RNA与染色质数据，研究团队重建了黑色素瘤细胞的连续表型轨迹——从分化的黑色素细胞态，经由神经嵴样中间态，到去分化的未分化耐药态。分析发现，52个扰动可显著驱动细胞向耐药状态迁移，且这一效应与独立bulk筛选中测定的生长优势高度一致（Pearson r = 0.594），充分说明PerturbFate的多组学读出能够忠实反映真实的细胞功能变化。
多基因扰动汇聚于共同转录因子调控枢纽
进一步的调控网络分析揭示，不同基因的缺失尽管各有其机制，却共同激活了一个由FOSL1、KLF5、RREB1、SMAD3等转录因子构成的高度协作调控枢纽。在所有耐药相关扰动中，这些转录因子的调控活性表现出显著的正相关——这意味着，不同遗传背景下的耐药并非各自为政，而是汇聚于同一套转录程序之上。正如研究团队所言：“我们开始将耐药不再看作一份不断增长的‘靶点清单’，而是看作围绕共同调控逻辑构建的结构性问题——这或许更具可干预性。”借助新生RNA提供的实时转录信息，团队还进一步鉴定出Hippo/YAP信号通路是这一汇聚调控枢纽的核心上游驱动力，YAP依赖性基因程序在去分化耐药状态中普遍激活。
联合靶向验证：组合阻断比单点打击更有效
鉴定出汇聚调控枢纽之后，研究团队在维罗非尼处理条件下检验了同时干预多个节点的效果。结果显示，单独抑制SMAD3或单独敲降RREB1对耐药的影响均十分有限；然而，将两者联合使用，则显著削弱了耐药细胞群体的整体生长优势，进一步加入KLF5抑制后效果更为突出。这一结果直接验证了汇聚调控枢纽中多个转录因子相互协作、功能互补的特性——单点干预难以突破，组合阻断才能有效瓦解耐药程序，为未来联合用药策略的设计提供了具体的分子逻辑。
Mediator复合体与汇聚效应因子VEGFC
研究团队还重点剖析了Mediator复合体各模块扰动对细胞状态的差异性影响。Mediator复合体是连接转录因子与RNA聚合酶的核心转录共激活子，激酶模块（以MED12为代表）的敲低持续激活炎症基因程序，并通过解除对Core Mediator的抑制促进YAP驱动的转录，从而推动细胞去分化——其中MED12敲低在有药无药条件下均产生最强的耐药效应，且这一效应独立于激酶模块其他组分之外。更引人关注的是，血管内皮生长因子C（VEGFC）被鉴定为跨越不同Mediator扰动的共同下游效应因子，功能验证证实VEGFC敲低可显著削弱多个耐药扰动的生长优势，揭示其作为汇聚治疗靶点的潜力。
意义与展望
PerturbFate将高通量CRISPR筛选的信息维度从“单声道”提升到“多声道”，同时保持极低的实验门槛与成本。这项研究更重要的概念性贡献在于：它证明了不同遗传扰动可以汇聚于同一套调控逻辑——这一发现改变了研究者理解疾病耐药机制的视角，也为寻找可干预的共同靶点提供了框架。
从更广泛的视角看，PerturbFate同样适用于组织再生、免疫激活、衰老等多种需要理解细胞命运决定机制的生物学场景——凡是涉及瞬时、异质或汇聚性细胞状态转变的问题，都是PerturbFate的用武之地。
曹俊越实验室（Laboratory of Single Cell Genomics and Population Dynamics）隶属于The Rockefeller University，研究方向聚焦于单细胞多组学技术开发，以及这些技术在衰老和神经科学中的应用。在技术创新方面，实验室近年来持续推出新一代单细胞平台：2023年在Nature Biotechnology发表PerturbSci-kinetics，将CRISPR筛选与代谢标记新生RNA相结合，在单细胞水平系统解析了基因扰动对转录动态（涵盖RNA合成、加工与降解）的影响；2024年开发了无需光学成像设备的空间基因组学平台IRISeq；2025年在Cell Genomics发表EnrichSci，一种基于杂交链式反应的靶向细胞富集测序平台，可对特定稀有细胞类型（如脑内少突胶质细胞亚型）进行高深度单核转录组分析。在衰老图谱方面，实验室于2023年在Nature Genetics完成了人类和小鼠脑衰老及阿尔茨海默病的系统性单细胞图谱研究；2024年在Science绘制了涵盖14个器官、超过2100万个单细胞的哺乳动物衰老转录组图谱；2025年在Cell Reports揭示了热量限制对哺乳动物脑衰老的时空调控；2026年2月再次在Science发表了涵盖21个组织、约700万个单细胞的全身染色质可及性衰老图谱，系统阐明了衰老过程中细胞动态与表观基因组重塑的规律，相关数据库已公开发布于epiage.net。
附曹俊越团队近年来部分工作：
（2019）
（2020）
（2020）
（2023）
（2023）
（2024）
（2026）
https://www.nature.com/articles/s41586-026-10367-0
制版人： 十一
学术合作组织
（*排名不分先后）
战略合作伙伴
（*排名不分先后）
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