骨髓炎是一种由病原微生物（尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA）感染引起的难治性骨科疾病，常伴有持续性炎症反应，最终导致骨组织破坏。目前临床标准治疗主要依赖广泛清创联合长期、高剂量全身抗生素给药。然而，这些方法存在显著局限性：手术清创难以完全去除生物膜，而生物膜中的细菌对抗生素的耐药性可提高10-1000倍；抗生素在骨组织中渗透性低，长期滥用易导致细菌耐药性增强和全身副作用；此外，感染引发的过度炎症反应不仅会诱导组织坏死和血供紊乱，还会破坏局部骨微环境，阻碍骨组织的自然修复过程。因此，开发能够同时抗感染和调节炎症的新型多功能生物材料，实现全面高效的骨髓炎治疗，已成为当务之急。
针对上述挑战，上海交通大学附属第六人民医院沈龙祥主任、上海大学耿弼江副研究员和潘登余研究员合作，首次报道了一种基于高生物相容性、共价交联的多功能碳点平台的一体化水凝胶设计。该水凝胶通过同时调控抗菌、抗炎和成骨活性，实现了细菌特异性可控释放。研究人员通过边缘接枝儿茶酚和核心掺杂Se-Se键两种结构修饰，获得了多功能碳点，并利用其与苯硼酸接枝的海藻酸钠形成具有可解离硼酸酯键的动态交联复合水凝胶。在MRSA诱导的骨髓炎模型中，该碳基复合水凝胶实现了骨缺损的近完全愈合，为利用多功能碳点构建动态交联水凝胶用于按需治疗骨髓炎提供了新范式。相关论文以“Dynamically Crosslinked Carbon Dot/Alginate Hydrogels for On-Demand Osteomyelitis Therapy”为题，发表在Advanced Materials上。
示意图1 用于骨髓炎治疗的具有同时抗菌、抗炎和成骨活性的骨髓炎微环境响应性Cat-SeCD@Gel水凝胶的构建示意图及其应用。(a) Cat-SeCD、PBA-SA和Cat-SeCD@Gel水凝胶的制备过程。(b) Cat-SeCD@Gel水凝胶中Cat-SeCD的骨髓炎微环境响应性按需释放机制。(c) Cat-SeCD@Gel水凝胶用于按需骨髓炎治疗的抗菌和抗生物膜活性、ROS清除和抗炎活性以及成骨活性的机制示意图。
碳点的合成与表征
研究人员采用一步水热分子融合策略合成了三种带负电的碳点。透射电镜和高分辨透射电镜图像显示，无儿茶酚碳点、儿茶酚功能化碳点和儿茶酚功能化硒掺杂碳点均呈现单分散点状形貌，尺寸约为4纳米，均显示出间距为0.21纳米的清晰晶格条纹，对应于石墨的（100）晶面。X射线衍射图谱在21.2°、20.5°和23.6°处出现宽而突出的峰，拉曼光谱中D带和G带的ID/IG比值分别为0.923、0.911和0.897，表明儿茶酚修饰和硒掺杂引入了结构缺陷。傅里叶变换红外光谱和X射线光电子能谱分析证实了碳点的化学组成，其中硒掺杂碳点的高分辨Se 3d谱在55.6和56.8 eV处出现两个峰，对应C-Se和Se-Se键。FeCl3显色反应中，儿茶酚功能化碳点和硒掺杂碳点溶液变为绿色，证实了儿茶酚结构的成功功能化。光学性质方面，无儿茶酚碳点和儿茶酚碳点溶液呈黄色并发射黄色荧光，而硒掺杂碳点溶液在365 nm紫外光下发射红色荧光，吸收峰出现红移，有利于体内示踪。
图1 Cat-free-CD、Cat-CD和Cat-SeCD的合成与表征。(a) 三种碳点合成过程示意图。(b-g) Cat-free-CD（b、e）、Cat-CD（c、f）和Cat-SeCD（d、g）的TEM和HRTEM图像。(h-n) 三种碳点的XRD（h）、Raman（i）、FTIR（j）、XPS全谱（k）、高分辨C 1s（l）、O 1s（m）和Se 3d（n）光谱。(o) 三种碳点的FeCl3显色反应测试（G1：CA + FeCl3；G2：Cat-free-CD + FeCl3；G3：Cat-CD + FeCl3；G4：Cat-SeCD + FeCl3）。(p-r) Cat-free-CD（p）、Cat-CD（q）和Cat-SeCD（r）的吸收光谱和荧光光谱。
抗菌活性评估
研究团队选用MRSA、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌评估了三种碳点的抗菌活性。随着碳点浓度增加，无儿茶酚碳点组对四种细菌均无显著抗菌效果，而儿茶酚碳点和硒掺杂碳点组表现出明显的浓度依赖性抗菌活性。值得注意的是，硒掺杂碳点在200 µg/mL浓度下能完全杀灭所有四种细菌，对MRSA和铜绿假单胞菌的MIC90为100 µg/mL。机制分析表明，儿茶酚碳点可通过表面儿茶酚基团与细菌膜蛋白相互作用，破坏膜完整性导致内容物泄漏；而硒掺杂碳点除共享膜损伤机制外，还能利用Se-Se键掺杂的生物活性特异性催化细菌抗氧化剂谷胱甘肽氧化为氧化型谷胱甘肽，破坏细菌氧化还原平衡，从而表现出更强的抗菌活性。活/死染色和扫描电镜图像进一步证实，硒掺杂碳点组细菌形态发生显著变化——革兰阳性球菌表面出现明显裂纹，革兰阴性杆菌出现不同程度皱缩、塌陷或融合。蛋白泄漏分析和GSH/GSSG比值测定显示，硒掺杂碳点处理组上清液中蛋白含量最高、沉淀中蛋白含量最低，且GSH/GSSG比值显著降低。在MRSA感染小鼠伤口模型中，硒掺杂碳点组在第9天实现完全细菌根除，而儿茶酚碳点组在第12天才完成，伤口愈合情况与细菌清除模式一致，且所有组体重保持稳定，证实了良好的生物安全性。
图2 Cat-free-CD、Cat-CD和Cat-SeCD的抗菌效果评估。(a) 三种碳点对MRSA、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的浓度依赖性抗菌活性菌落图。(b) Cat-SeCD的抗菌机制示意图。(c、d) 不同处理后MRSA、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活/死染色（c）和SEM图像（d）。(e、f) 不同处理后MRSA（e）和铜绿假单胞菌（f）的蛋白泄漏分析。(g) 不同处理后MRSA和铜绿假单胞菌中GSH/GSSG比值。(h、j) 不同处理后小鼠MRSA感染伤口区域的照片（h）和定量分析（j）。(i) 不同处理后MRSA菌落的照片。数据以平均值±SD表示（n=3）。p<0.01，*p<0.001。
抗生物膜活性
生物膜中的细菌对抗微生物治疗的耐药性可比浮游细菌高1000倍，因此根除生物膜对高效治疗感染相关疾病至关重要。结晶紫生物膜染色结果显示，无儿茶酚碳点不能抑制MRSA和铜绿假单胞菌的生物膜形成，而儿茶酚碳点和硒掺杂碳点组均表现出降低的紫色强度和OD595值，其中硒掺杂碳点组降低更为显著。共聚焦显微镜获取的活/死染色生物膜三维图像中，硒掺杂碳点组绿色荧光消失、红色荧光增强，表明生物膜被完全破坏。对未成熟和成熟生物膜上清液中活细菌的计数发现，硒掺杂碳点处理后四种细菌上清液中的活细菌数量均显著减少，细菌清除率超过90%。综上所述，硒掺杂碳点不仅能够抑制生物膜形成，还能破坏已形成的成熟生物膜，展现出优异的抗生物膜能力。
图3 Cat-free-CD、Cat-CD和Cat-SeCD的抗生物膜效果评估。(a-d、k-n) 不同处理后结晶紫染色的未成熟（a-d）和成熟（k-n）MRSA和铜绿假单胞菌生物膜的照片和定量分析。(e、f、o、p) 不同处理后SYTO 9/PI染色的未成熟（e、f）和成熟（o、p）MRSA和铜绿假单胞菌生物膜的三维图像。(g-j、q-t) 不同处理后未成熟（g-i）和成熟（q-t）MRSA和铜绿假单胞菌生物膜中活菌的照片和定量分析。数据以平均值±SD表示（n=3）。***p<0.001。
ROS清除与抗炎活性
细菌感染时，免疫细胞被迅速激活，释放大量ROS和促炎因子，损伤周围健康组织。研究团队首先利用DPPH和ABTS评估了三种碳点的总抗氧化能力，结果显示硒掺杂碳点清除效率最高（DPPH· 81.2%，ABTS+· 92.6%），其次为无儿茶酚碳点和儿茶酚碳点。针对特定ROS的清除实验表明，硒掺杂碳点清除81.3%的·OH和87.4%的O2·−。利用DCFH-DA评估细胞H2O2清除能力时，硒掺杂碳点组荧光强度显著降低至对照组的32%，并将GSH-Px活性提高约61.2%。在巨噬细胞极化调控方面，流式细胞术分析显示，硒掺杂碳点组CD86（M1标志物）阳性细胞比例从67.1%降至42.8%，CD206（M2标志物）阳性细胞比例从10.9%升至31.6%，表明硒掺杂碳点具有最强的促进巨噬细胞从促炎M1表型向抗炎M2表型极化的能力。伴随这一转变，炎症细胞因子TNF-α和IL-1β水平逐渐下降，抗炎细胞因子IL-10和IL-4水平相应升高。
图4 Cat-free-CD、Cat-CD和Cat-SeCD的ROS清除和抗炎活性。(a-d) 三种碳点的DPPH·（a）、ABTS+·（b）、·OH（c）和O2·−（d）清除能力。(e) 不同处理后暴露于H2O2的BMSCs的DCFH-DA染色图像。(f) 不同处理后BMSCs的相对GSH-Px活性。(g) 不同碳点ROS清除活性的比较。(i、j) 不同处理后RAW 264.7细胞中CD86（i）和CD206（j）表达的流式细胞术分析和定量分析（以F4/80细胞设门）。(k-n) 不同处理后RAW 264.7细胞中TNF-α（k）、IL-1β（l）、IL-10（m）和IL-4（n）的水平。数据以平均值±SD表示（n=3）。p<0.01，*p<0.001。
成骨活性评估
研究人员首先评估了三种带负电碳点的生物相容性。在0-200 µg/mL浓度范围内处理24或48小时后，BMSCs存活率均保持在90%以上，活/死细胞染色显示所有细胞均呈现绿色荧光，溶血率低于5%，划痕实验证实细胞迁移未受抑制。在成骨活性方面，茜素红染色和ALP染色结果显示，第14天时硒掺杂碳点组的ARS水平分别是对照组、无儿茶酚碳点组和儿茶酚碳点组的2.05、1.41和1.44倍；第7天时ALP水平是对照组的1.92倍，是无儿茶酚碳点组和儿茶酚碳点组的1.52和1.51倍。这表明所有带负电碳点均具有显著成骨活性，而硒掺杂可进一步增强该活性。
图5 Cat-free-CD、Cat-CD和Cat-SeCD的生物相容性和成骨分化评估。(a-c) 与Cat-free-CD（a）、Cat-CD（b）和Cat-SeCD（c）共培养24和48小时后BMSCs的存活率。(d) 暴露于三种碳点后红细胞的代表性图像和溶血率的定量分析。(e、f) 与三种碳点共培养0和48小时后BMSCs的活/死细胞染色（e）和细胞划痕实验（f）图像。(g-i) 不同处理7天和14天后BMSCs的代表性矿化结节（g）、ARS染色（h）和ALP染色（i）图像。(j-m) 不同处理7天和14天后矿化率（j、k）和ALP相对活性（l、m）的定量分析。数据以平均值±SD表示（n=3）。p<0.05，**p<0.001。
成骨机制研究
为阐明硒掺杂碳点的成骨分子机制，研究团队对处理后BMSCs进行了转录组测序分析。基因本体富集分析显示，上调的差异表达基因与成骨分化（成骨细胞分化、骨发育、骨形态发生和骨化）、BMP信号通路（Smad结合和Smad蛋白信号转导）、Wnt信号通路（Wnt信号体、连环蛋白复合物和β-catenin结合）以及TGF-β受体信号通路相关。热图显示硒掺杂碳点上调了成骨相关基因（Runx2、Sp7、Atf4、Col1a1、Col1a2）、BMP信号通路基因（Bmp1、Bmp4、Bmp1a、Smad1、Smad5）、Wnt信号通路基因（Wnt7b、Wnt10b、Lrp5、Lrp6、Fzd9、Ctnnb1）和抗氧化基因（Foxo1、Foxo3、Sod1、Gpx1、Gpx4、Gpx7、Gpx8）。Western blot分析进一步证实，三种碳点均能通过BMP/Smad通路促进BMSCs成骨分化，但只有硒掺杂碳点组表现出Wnt10b和β-catenin水平的显著升高，以及Runx2、OCN和OPN的最显著上调。因此，硒掺杂碳点能够同时激活BMP/Smad信号通路和Wnt/β-catenin信号通路，产生最强的成骨活性。
图6 Cat-SeCD的成骨机制。(a) 对照组和Cat-SeCD处理组BMSCs的主成分分析。(b) 对照组和Cat-SeCD处理组之间差异表达基因的火山图。(c) Cat-SeCD处理组中上调差异表达基因的GO富集分析。(d) 与成骨和抗氧化相关的差异表达基因的热图。(e-j) Western blot分析不同处理后BMSCs中BMP2、p-Smad1/5（e、h）、Wnt10b、β-catenin（f、i）、Runx2、OCN、OPN（g、j）的蛋白表达水平。(k) Cat-SeCD通过同时激活BMP/Smad和Wnt/β-catenin信号通路增强BMSCs成骨分化的示意图。
可注射CD交联水凝胶的设计与合成
为解决游离碳点注射后停留时间短的问题，研究团队设计并制备了可注射、pH/ROS双响应的碳点交联水凝胶。首先将3-APBA接枝到海藻酸钠分子链上获得PBA-SA，紫外-可见吸收光谱中245 nm处出现3-APBA特征峰，1H NMR谱中7.0-7.7 ppm处出现苯环质子峰，FTIR谱中1340和1287 cm-1处出现B-O键振动峰，高分辨N 1s谱中399.7 eV处出现B-NH-峰，证实了PBA的成功接枝。当儿茶酚封端的碳点与PBA-SA混合后，通过形成硼酸酯键在约2小时内完成凝胶化。扫描电镜观察到多孔网络结构，高分辨B 1s谱中约191.5 eV处出现B-O-C键峰，FTIR谱中B-O键振动峰显著减弱，证实了硼酸酯键的形成。凝胶化条件研究表明，pH 8.5碱性环境下约2小时成胶，pH 7.4中性环境下约6小时成胶，而酸性环境下无法成胶；温度对成胶无显著影响。
水凝胶的理化性质与响应性降解
两种碳点交联水凝胶在PBS（pH 7.4）中约8小时达到溶胀平衡，溶胀率约238%。在模拟感染微环境的低pH和/或高ROS条件下，两种水凝胶均表现出显著加速的降解行为，其中ROS环境下降解更快，而当pH 6.0和1 mM H2O2同时存在时降解最快，在168小时内完全降解。在PBS（pH 7.4）中，水凝胶可稳定存在至少60天，并在1680小时内完全降解。碳点的释放行为与水凝胶降解行为一致。流变学测试显示，硒掺杂碳点水凝胶的储能模量始终大于损耗模量，临界应变点约为495%，剪切强度为23.1 kPa，压缩强度为12.3 kPa。该水凝胶表现出优异的剪切变稀性能，可通过注射器顺畅挤出，并牢固粘附于心、肝、脾、肺、肾及人体皮肤组织。在小鼠尾部横断模型中，水凝胶组在30秒内实现止血，而对照组在120秒时仍可见活动性出血。切割后的水凝胶断端在接触5分钟后成功重新连接，弯曲手指时未见裂纹，展现出良好的自愈合性能。
图7 Cat-CD@Gel和Cat-SeCD@Gel的合成与表征。(a) Cat-CD@Gel和Cat-SeCD@Gel的合成过程示意图。(b-e) SA、PBA和PBA-SA的吸收光谱（b）、1H NMR谱（c）、FTIR谱（d）和高分辨N 1s谱（e）。(f-h) Cat-CD@Gel和Cat-SeCD@Gel的凝胶化过程（f）和SEM图像（g、h）。(i、j) PBA-SA（i）和Cat-SeCD@Gel（j）的高分辨B 1s谱。(k) Cat-CD@Gel和Cat-SeCD@Gel的FTIR谱。(l) Cat-CD@Gel和Cat-SeCD@Gel的溶胀率。(m、n) Cat-SeCD@Gel在不同条件下初始7天（m）和336至1680小时（n）内的剩余重量比。(o、p) Cat-SeCD@Gel的可注射性（o）和粘附性能（p）。(q、r) 不同处理后（小鼠尾部切断模型）出血量（q）和定量分析（r）的照片。数据以平均值±SD表示（n=3）。***p<0.001。
CD交联水凝胶的生物功能评价
生物相容性评估显示，与BMSCs共培养48小时后，细胞存活率保持在95%以上，活/死染色未见红色荧光细胞，划痕实验和溶血测试未见不良影响，皮下移植后H&E染色未见明显炎症反应。抗菌和抗生物膜性能测试中，硒掺杂碳点水凝胶实现了四种细菌100%的根除率，结晶紫染色和三维图像显示生物膜被完全破坏，呈现全部红色荧光。ROS清除方面，硒掺杂碳点水凝胶对DPPH·、ABTS+·、·OH和O2·−的清除率分别为80.7%、93.8%、92.3%和77.6%，并将BMSCs中GSH-Px活性显著提高，细胞内H2O2清除效率达63.7%。在LPS诱导的炎症条件下，硒掺杂碳点水凝胶将M1表型巨噬细胞从67.0%降至43.8%，M2表型从8.42%升至33.1%。成骨活性评估中，第14天时硒掺杂碳点水凝胶诱导的细胞矿化水平是儿茶酚碳点水凝胶组的1.56倍、对照组的2.23倍；第7天ALP活性是儿茶酚碳点水凝胶组的1.35倍、对照组的1.65倍。值得注意的是，硒掺杂碳点与水凝胶形式之间的抗菌/抗生物膜、ROS清除、抗炎和成骨分化性能无显著差异，而与非动态GelMA水凝胶相比，动态交联水凝胶在低pH和高ROS环境下响应性降解更快，从而在短时间内实现更优的生物学性能。
图8 Cat-SeCD@Gel的抗菌、抗生物膜、ROS清除、抗炎和成骨活性。(a-c) 不同处理后MRSA和铜绿假单胞菌的菌落（a）、结晶紫染色生物膜（b）和SYTO 9/PI染色生物膜的三维图像（c）。(d、e) 不同处理后MRSA和铜绿假单胞菌的抗菌效率（d）和结晶紫染色生物膜（e）的定量分析。(f-i) 不同样品的DPPH·（f）、ABTS+·（g）、·OH（h）和O2·−（i）清除能力。(j) 不同处理后BMSCs的相对GSH-Px活性。(k、l) 不同处理后RAW 264.7细胞中CD86（k）和CD206（l）表达的流式细胞术分析和定量分析（以F4/80细胞设门）。(m-o) 不同处理后BMSCs的代表性矿化结节（14天）、ARS染色（14天）和ALP染色（7天）图像及定量分析。数据以平均值±SD表示（n=3）。p<0.01，*p<0.001。
MRSA感染糖尿病伤口的治疗效果
研究人员建立了MRSA感染糖尿病伤口模型评估治疗效果。结果显示，第6天时硒掺杂碳点水凝胶组伤口面积比对照组减少74.3%，第15天时伤口几乎完全愈合，而对照组仍可见明显残留伤口。MRSA菌落计数显示，硒掺杂碳点水凝胶组在第12天实现完全清除，而儿茶酚碳点水凝胶组需要额外3天。H&E和Masson染色显示，硒掺杂碳点水凝胶组炎症细胞浸润最少，表皮完全再生，肉芽组织宽度最窄（2.1 mm，为对照组一半）、厚度最大（0.98 mm，为对照组2.51倍），胶原沉积成熟且排列有序。
图9 MRSA感染糖尿病伤口的治疗效果评估。(a) 糖尿病小鼠及其GLU结果的代表性图像。(b) MRSA感染糖尿病伤口的治疗时间表示意图。(c) 不同处理后小鼠MRSA感染糖尿病伤口的照片。(d、h) 不同处理后小鼠伤口面积的轨迹（d）和定量分析（h）。(e、i) 不同处理后MRSA的菌落照片（e）和存活率分析（i）。(f、g) 第15天伤口组织的H&E（f）和Masson（g）染色代表性图像。(j、k) 第15天肉芽组织宽度（j）和肉芽组织厚度（k）的定量分析。数据以平均值±SD表示（n=3）。***p<0.001。
MRSA感染骨髓炎的治疗效果
在MRSA诱导的骨髓炎模型中，第4周时硒掺杂碳点水凝胶组伤口明显愈合且未检出细菌，第8周时伤口被新生毛发覆盖，骨缺损几乎完全愈合。血常规和血生化分析显示，对照组、海藻酸钠组和PBA-SA组白细胞水平显著升高并出现贫血，而硒掺杂碳点水凝胶组白细胞和红细胞水平恢复正常，白蛋白和球蛋白水平也恢复正常。Micro-CT成像和定量分析进一步证实，硒掺杂碳点水凝胶组的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度均最高，骨小梁分离度最低。H&E和Masson染色显示，硒掺杂碳点水凝胶组炎症细胞最少，胶原沉积最丰富且结构良好。免疫荧光分析显示，硒掺杂碳点水凝胶组M1巨噬细胞标志物iNOS表达最低，M2巨噬细胞标志物ARG1表达最高。主要器官H&E染色未见损伤或坏死，证实了良好的生物安全性。
图10 MRSA感染骨髓炎的治疗效果评估。(a) MRSA感染骨髓炎的治疗时间表示意图。(b) 不同处理后MRSA感染骨髓炎伤口的照片。(c) 不同处理后从感染组织获得的MRSA菌落。(d-g) 不同处理8周后骨髓炎小鼠模型的WBC（d）、RBC（e）、ALB（f）和GLOB（g）水平。(h) 不同处理4周和8周后感染胫骨样本的宏观图像。数据以平均值±SD表示（n=3）。*p<0.05，**p<0.001。
图11 MRSA感染骨髓炎中的骨形成评估。(a) 不同处理4周和8周后胫骨缺损的Micro-CT图像。(b、c) 不同处理8周后感染胫骨组织的H&E（b）和Masson（c）染色图像。(d、e) 不同处理8周后感染胫骨组织中iNOS（红色：iNOS，蓝色：细胞核）和ARG1（红色：ARG1，蓝色：细胞核）的免疫荧光图像。(f-j) 不同处理8周后感染胫骨组织中BMD（f）、BV/TV（g）、Tb. N（h）、Tb. Th（i）和Tb. Sp（j）的定量分析。数据以平均值±SD表示（n=3）。***p<0.001。
总结与展望
本研究首次报道了一种基于高生物相容性、多功能集成的碳点平台的共价交联一体化水凝胶设计，通过一步水热分子融合策略系统调控碳点的微观结构和理化性质，揭示了涉及生物安全性、抗菌、抗炎和成骨活性的复杂构效关系。儿茶酚末端功能化赋予碳点选择性抗菌机制，即通过表面儿茶酚基团增强与细菌膜蛋白的相互作用，从而破坏膜完整性并引起内容物泄漏。更重要的是，儿茶酚末端功能化通过与PBA-SA交联，实现了共价交联的碳基水凝胶注射剂的设计。硒元素掺杂进一步优化了儿茶酚功能化碳点及其水凝胶注射剂的性能，通过更精确的ROS调控和Wnt/β-catenin信号通路激活，带来额外的抗菌、抗炎和成骨活性。最终构建的pH/ROS双响应碳点水凝胶在MRSA感染糖尿病伤口和MRSA感染骨髓炎中展现出最佳愈合效果。这项工作为从多功能碳点构建动态交联水凝胶用于按需治疗提供了新范式。
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