JCB丨建立体外多能干细胞模型—rfISCs|JCB|多能干细胞|激活剂|细胞系

哺乳动物胚胎在着床前和着床后经历一个高度动态发育过程，从这个阶段不同时期的胚胎中分离建立的多能性干细胞的发育潜能明显不同，然而现有的体外多能干细胞模型只能代表固定的发育时间点，无法完整模拟这一连续、渐变的转变过程，调控这一过渡阶段的核心信号通路和转录网络尚未被解析，限制了人们对于早期胚胎发育的认识。

近日，安徽大学叶守东团队与同济大学刘文强团队在Journal of Cell Biology上发表研究论文，题为Bistable Otx2-Id1 circuitry governs adevelopmental transition state in the pluripotency continuum。该研究通过联合使用MEK抑制剂（ PD0325901 ）、Wnt抑制剂（ IWR1 ）和PKA激活剂（ Forskolin ），成功建立了一种新型多能干细胞系，命名为rfISCs（ rosette-formative intermediate stem cells ），并系统揭示了其背后的分子调控机制。

rfISCs的全基因转录表达谱接近小鼠E5.0和E5.5上胚层， PCA 等方法分析显示 rfISCs 在不同类型多能干细胞系中形成独立中间簇，位置介于 RSCs （ E5.0 ）和 FSCs （ E5.5 ）之间。单细胞测序和拟时序分析进一步证实， rfISCs 在发育轨迹上紧密对应 E5.25 和 E5.5 的胚胎细胞。 rfISCs 在体外可高效分化为原始生殖细胞样细胞，在体内通过胚胎注射能够形成嵌合小鼠，并能够产生可育后代。

随后，研究者解析了维持 rfISCs 身份的核心机制 —Otx2–Id1 双稳态环路。研究发现，在 MEK 抑制剂存在下， IWR1 激活 Otx2 表达，驱动细胞向形成态干细胞特化并启动神经分化； PKA 激活剂（ Forskolin ）通过 cAMP–PKA–CREB 通路上调 Id1 ，抑制 Otx2 驱动的神经分化。 Otx2 与 Id1 构成双稳态环路，共同维持 rfISCs 的稳定。功能缺失与回补实验进一步验证了这一机制：敲除 Tcf7l1 或 Otx2 均导致 rfISCs 无法形成；而同时过表达 Otx2 和 Id1 ，即使不添加 IWR1 和 Forskolin ，也可以直接诱导出与 rfISCs 高度相似的细胞。

最后，研究者直接从小鼠 E5.25 上胚层中分离细胞，并在含 PD0325901 、 IWR1 和 Forskolin 的培养基中培养，在体外可以成功建立长期传代的 rfISCs 细胞系。这些细胞在分子特征、功能表型和嵌合能力上与体外诱导的 rfISCs 一致。

综上所述，该研究建立了一个新的体外多能干细胞模型 — rfISCs ，与小鼠 E5.0–E5.5 的上胚层细胞对应。更重要的是，该研究揭示了 Otx2–Id1 双稳态环路作为这一群过渡细胞形成和维持的分子 “ 开关 ” ，阐明了 Wnt –PKA 信号如何通过转录因子网络实现发育状态的有序推进与稳定性维持。研究结果为理解哺乳动物早期胚胎中多能性状态的连续转变提供了新视角，也为在体外模拟发育过程、优化干细胞分化方案以及探索发育相关疾病提供了新材料。