随着ADC药物管线持续扩容、同类靶点扎堆布局，差异化品质与硬核技术壁垒已成为药物突围的核心关键，整体监管标准也随之持续迭代、门槛大幅抬升，面对去泛化、精细化、标准化的审评已成ADC行业之大趋势。
考虑到 ADC产品的复杂性和特殊性，为了规范和指导ADC 产品的开发和上市，药审中心组织制定了《抗体偶联药物药学研究与评价技术指导原则》，原则中明确提出：应结合ADC产品结构特点，对偶联位点及各位点偶联比例进行表征。由此，偶联位点及位点比例的深度表征已成为衡量一款ADC药物质量的“金标准”， 也是产品立项研发、临床试验、上市申报的硬性核心门槛之一。如何在这一关键环节做到合规且精准，是摆在每一位研发者面前的必答题。
从实际情况出发，当前复杂ADC分子的开发仍存在诸多技术痛点亟待破解。特别是当遇到含聚合物连接子的复杂分子时，连接子固有的高异质性与质谱信号抑制效应，往往让传统分析方法束手无策。凯莱英生物突破性开发了基于同位素标记的创新分析策略，该方法巧妙绕开了聚合物连接子异质性的干扰，通过偶联前后肽段响应的精准比对，为这类高难度ADC分子的表征研究提供了强有力的数据支撑。
传统偶联位点占有率分析方法
传统的偶联位点占有率计算根据样品中偶联/未偶联肽段响应的相对比例进行定量，需要偶联后肽段响应能够根据分子量被准确提取（如图1）。
图1传统Linker-Payload偶联肽段不同形式XIC
注：XIC：提取离子色谱图；Linker-Payload：连接子-载荷
传统偶联位点占有率计算方式：位点占有率=偶联肽段质谱响应/(未偶联肽段质谱响应+偶联肽段质谱响应)
聚合物连接子因本身的高异质性（分子量并非均一），质谱响应差（通常离子化效率低）等因素，无法根据准确的分子量进行提取并得到响应值（如图2）。
图2高聚物连接子偶联肽段XIC
注：蓝绿色阴影部分为高聚物连接子偶联肽段的流出区域；XIC：提取离子色谱图
创新偶联位点占有率分析方法
创新方法另辟蹊径，前处理使用偶联前后蛋白样品分别通过轻/重同位素试剂标记，再取等量混合酶切后经质谱采集数据（前处理流程如图3）。
图3创新偶联位点占有率分析前处理流程图
数据处理过程，首先选取非目标偶联肽段作为样本的响应“校正肽段”，根据“校正肽段”中轻/重同位素标记组分响应比值得到质谱信号校正系数N。（如公式1）在目标偶联肽段中，轻/重同位素标记未偶联组分响应比值经校正系数归一化处理后，即可得到位点占有率信息（如图4和公式2）。
图4校正肽段（非目标偶联肽段）对质谱响应归一化示意（左上）；目标偶联肽段中未偶联组分质谱响应差异计算位点占有率示意（右上）；TIC：总离子流色谱图（下)
该方法对理论DAR值约为4.0的标准品进行分析后，通过偶联位点占有率计算得到的DAR值约为4.0，其结果与理论值及其它方法检测得到的结果基本一致。证明该分析方法能够提供肽图水平下的药物分布及载量信息。依托该分析方法，成功推进多项药物分子的偶联位点占有率分析，为表征研究提供有力支持。
平台优势
突破表征瓶颈：攻克含聚合物连接子ADC因连接子高异质、质谱响应差的行业难题，契合CDE指导原则对偶联位点的严格表征要求。
定量逻辑科学：采用轻/重同位素双标策略，规避传统方法对分子量均一性的依赖，通过响应差异精准计算位点占有率。
数据精准可信：实测DAR值与理论值及交叉验证结果高度吻合，可稳定输出肽图水平的药物分布及载药量信息。
赋能管线落地：已完成多项目验证，可高效支撑客户ADC新药研发的表征研究及注册申报工作，加速推进进程。
结语
此次创新方法的成功验证与应用，再次印证了凯莱英生物在ADC细分领域的技术敏锐度与落地执行力。我们不仅关注技术的先进性，更致力于将技术转化为切实的研发动能，帮助客户解决从早期开发到临床申报过程中的“卡脖子”难题，有效缩短研发周期，降低开发风险。未来，凯莱英生物将继续依托在偶联药物领域的全流程服务能力，以技术创新为驱动，不断突破工艺开发与质量研究的边界，致力为全球合作伙伴提供更精准、更高效、更合规的一站式解决方案，护航更多创新药物从实验室走向临床，惠及广大患者。
参考文献
【1】国家药品监督管理局药品审评中心. 抗体偶联药物药学研究与评价技术指导原则. 2024.
【2】Tyler K. Davis Mark E. Jennings. Site-Specific Conjugation Quantitation of a Cysteine-Conjugated Antibody−Drug Conjugate Using Stable Isotope Labeling Peptide Mapping LC−MS/MS Analysis. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04025.
关于凯莱英生物AsymBio
凯莱英生物是凯莱英医药集团（股票代码：002821.SZ/6821.HK）战略新兴业务，聚焦于生物药CDMO服务。凭借先进的技术平台以及丰富的项目经验，为全球客户提供各类新型偶联药物、抗体和重组蛋白药物等一站式CDMO解决方案，具备早期研发、工艺开发、毒理批次、临床批次和商业化批次生产的端到端服务能力。凯莱英生物致力于成为全球生物药客户值得信赖的合作伙伴，赋能全球生物医药创新，加速药品上市进程。更多信息，请访问：www.asymbio.com.cn
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