《Science》PVA强韧水凝胶，增强细菌疗法|Science|pva|基质|微凝胶|水凝胶|细菌疗法

微生物作为活体疗法的应用日益广泛，但其在体内无序传播仍是临床应用的一大障碍。由于细菌最终会逃逸，物理隔离方法大多难以实现。本研究提出了一种可植入材料，能够包封并限制细菌，其中合成工程菌可在内部产生治疗性药物。我们开发了一种具有双重力学特性的水凝胶支架：高刚度用于调控细菌增殖，高韧性则可抵抗生理应力下的材料断裂。该设计实现了长达6个月的细菌完全包封，并经受住了多种可能导致材料灾难性失效的力学载荷。通过基因编辑嵌入细菌，我们赋予了材料环境感知和按需释放治疗药物的功能，并在小鼠人工关节感染模型中验证了其自主治疗效果。

合成工程化细胞正作为一种活体治疗手段崭露头角，能够感知生理环境并在体内产生生物活性药物。其中一类颇具前景的细菌可定植于多种生理环境，包括宿主细胞内的微环境、黏膜、感染部位、表皮、炎症组织以及肿瘤。然而，控制微生物脱靶效应仍是关键的安全考量，因为在多种临床场景中均有播散及毒性反应的报道。基因调控策略可实现低逃逸率的控制，但进化压力可能导致在涉及大量细菌群体和长期驻留的应用中累积逃逸风险。

可植入水凝胶为将治疗性细胞限制在靶向位点提供了一种物理策略。这类活体材料有望作为局部药物储库，能够动态响应病变环境。尽管此前研究主要聚焦于封装哺乳动物细胞，但这些细胞对缺氧和无血管植入环境的固有敏感性导致其失去活性。鉴于微生物在这些条件下具有良好的存活能力，采用可植入水凝胶封装细菌为材料与活体治疗载体的互补性提供了契机。然而，大量前期工作仅报道了短期封装效果，通常导致细菌最终从封装材料中逃逸，而体内植入物的长期限制仍未实现。

图1. ILM的设计和机械特性

满足材料的两个关键标准可以实现对治疗性细菌的坚固耐用的遏制：（i）对增殖细菌产生的内力的抵抗力，以及（ii）足以承受周围组织变形的机械韧性。此外，制造过程需要具有生物相容性，以保持细菌的存活能力。基于这些原理构建的可植入活体材料（ILM）在体内实现了稳定的微生物控制，从而实现了疾病感应和自主治疗释放（图1A）。

基质硬度限制细菌增殖

细菌在封闭条件下产生的增殖压力超过~300 kPa，比哺乳动物细胞通常产生的力大约大两个数量级。为了评估刚性包封基质是否能够抵抗这种生物量膨胀，我们制备了硬度增加的生物相容性琼脂糖水凝胶，并使用延时显微镜追踪细菌生长（图1B）。随着基质刚度的增加，菌落膨胀率降低（图1B），这与之前的研究一致，这表明存在一种机械反馈机制，其中周围物质调节细菌生长。接下来，我们研究了治疗应用中使用的细菌菌株之间的这种关系是否不同。尽管应变表现出不同的基线增长率，但随着基质刚度的增加，所有应变都表现出类似的膨胀减少。

为了确定这种刚度增长关系是否适用于各种材料平台，我们测试了由不同聚合物类型、浓度和分子量组成的水凝胶库。在所有测试系统中，较高的刚度持续抑制细菌膨胀（图1C）。与刚度相比，其他机械性能，包括抗拉强度、断裂功和断裂应变，与生长速率的关联较弱且不太一致。最后，我们测试了高刚度是否可以完全阻止Ecc的生长。在基于琼脂糖和聚乙二醇的系统中，当基质刚度超过约1.5 MPa时，菌落膨胀停止（图1C）。在这个模量下，细菌可能无法使周围的基质变形，从而建立了限制ILM中细菌增殖所需的刚度阈值。

聚乙烯醇水凝胶能够实现坚硬、坚韧和细菌兼容的封装

人体组织会持续运动，这会施加机械应力并损坏植入材料。因此，除了坚硬之外，ILM还必须坚固，以防止材料断裂和细菌大量逃逸。然而，根据Lake Thomas理论，增加材料刚度通常会导致脆性。尽管已经设计了几种水凝胶来克服这种权衡，但许多水凝胶依赖于与活细菌不相容的成分和制造方法。先前报道的包裹治疗性大肠杆菌的水凝胶不能同时达到足够的刚度和断裂韧性。作为解剖应力的基准，我们使用了软胶原组织骨折的报道工作，~0.5MJ/m3。

为了开发既坚硬又坚韧的ILM，作者转向了一类通过致密晶域交联的水凝胶。这种晶畴结构通过充当刚性颗粒来提供高刚度，同时分散应力以抵抗裂纹扩展。聚乙烯醇（PVA）因其低毒性、化学稳定性和已确立的临床用途而被选为基础聚合物。PVA分子同一性和分子量独立验证。由于增加PVA结晶度的制造工艺会损害细菌的存活率，我们优化了三种常用的诱导结晶方法：冻融循环、干退火和霍夫迈斯特效应介导的盐析过程。在-80°C下冷冻大大降低了Ecc的存活率，但将温度调节到-20°C可以保持细菌的存活，同时仍然促进PVA结晶。干退火通常需要在100°C下完全干燥，这与Ecc不相容。将退火温度降至37°C，并加入已知的干燥保护剂——藻酸盐或明胶——即使在24小时后，也能显著提高存活率 干燥时间。对于Hofmeister盐析法，我们测试了三种强促静电盐：硫酸钠（Na2SO4）、柠檬酸钠（Na3C6H5O7）和植酸钠（Na12C6H6O24P6）。硫酸钠对Ecc的存活率影响甚微，而植酸钠和柠檬酸钠则能迅速杀死Ecc。中和溶液的pH值恢复了活力。优化的ILM制造工艺与大肠杆菌Nissle 1917菌株兼容，但不能推广到革兰氏阳性枯草芽孢杆菌。

使用这些优化的制造条件（冻融循环、干退火和盐析），我们接下来的目标是在PVA水凝胶中实现足够的刚度和韧性，以容纳Ecc。我们测试了包括聚合物分子量和浓度、冷冻时间和温度、冻融循环次数、干退火时间以及盐类型和浓度在内的参数。几种组合产生了弹性模量为~3的水凝胶 MPa，断裂功超过20 MJ/m3，超过了抵抗细菌膨胀和承受组织级机械应力所需的阈值。为了更直接地评估韧性，我们使用纯剪切试验测量了PVA和具有匹配刚度的琼脂糖水凝胶的断裂韧性。所得PVA水凝胶的断裂韧性>5 kJ/m2，比脆性琼脂糖高一个数量级。由于植入材料会受到反复加载，我们还使用循环裂纹扩展测试评估了疲劳抗性。增韧PVA显示出约450的高疲劳阈值 J/m2，表示比琼脂糖提高了10倍以上。PVA的其他机械性能，包括断裂应变和抗拉强度，也至少超过琼脂糖一个数量级。根据x射线散射测量计算出PVA水凝胶的平均晶间间距为13.5nm。基于机械和溶胀的分析得出交联值之间的摩尔质量约为103 g/mol，表明存在紧密交联的网络。

ILM能够长期限制细菌并抵抗机械应力

接下来，我们试图通过在工程PVA基质中掺入细菌来建立ILM。理想的ILM应该包含内部空隙，以支持细菌的生长和活性。然而，引入这种机械薄弱区域可能会损害支架的整体完整性。为了平衡这些相互竞争的要求，我们计算出块状PVA的断裂粘合长度为~400μm，定义为断裂韧性与单位体积断裂功的比值。该长度估计了材料在不牺牲机械性能的情况下可以容忍的最大缺陷尺寸。基于这一阈值，我们制备了牺牲性微凝胶，将Ecc引入PVA内的微尺度空隙中。具体而言，使用油包水乳液产生含Ecc的微凝胶，并过滤以去除超过尺寸限制的颗粒。明胶被选为微凝胶材料，因为它能够保护Ecc免受干燥，并且在生理温度下具有热可逆凝胶化作用。为了确定允许的微凝胶负载量，我们改变了掺入PVA基质的微凝胶的体积分数。机械测试表明，在微凝胶分数低于~20%时，散装材料的性能得以保持，可能接近渗透极限。

图2. ILM在长期培养和机械加载过程中保持细菌控制

为了评估机械坚固性，ILM承受了一系列应力，并进行了细菌泄漏测试。具有匹配刚度的琼脂糖水凝胶作为对照。在模拟的压缩和拉伸载荷条件下，ILM没有释放出可检测的Ecc，而琼脂糖断裂并允许细菌逃逸。加载后存活率测定证实，在机械应力后，Ecc在完整的ILM内仍然存活。我们还通过在拉伸载荷之前在支架上引入凹口来模拟潜在的材料缺陷或损伤。尽管<150kPa左右的低应力水平会传播裂纹并从琼脂糖中释放细菌，但ILM即使在~500kPa下也能抵抗裂纹传播并防止逃逸。

ILM自主感知环境并释放治疗药物

ILM的一个有前景的应用是将其用作本地药物仓库。尽管可植入材料广泛用于局部治疗输送，但传统设计在给药动力学、可持续性和传感能力方面受到限制。ILM有可能通过基因工程植入细菌来感知疾病并按需生产药物，从而克服这些局限性。作为原理验证应用，我们专注于假体周围植入物感染，这些感染通常很难诊断，早期干预可以降低生态失调和抗生素耐药性的风险。铜绿假单胞菌感染尤其成问题，因为它与植入物表面有很强的相关性，并且对许多常见类别的抗生素具有固有的耐药性。尽管进行了额外的手术、清创和静脉注射抗生素，但高达75%的病例仍可能出现治疗失败。作者了一种遗传回路，能够自主感知铜绿假单胞菌，然后通过Ecc自裂解进行按需治疗释放（图3A）。我们将自主定义为ILM感知和响应环境线索的能力。具体而言，通过将N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）敏感的luxB启动子与自裂解E基因的表达偶联，在Ecc中构建了群体感应系统。在该系统中，在激活时实现单次治疗释放，而随机裂解使微生物能够再生以进行后续激活。为了评估传感性能，作者带绿色荧光蛋白（GFP）耦合传感器电路的Ecc暴露于铜绿假单胞菌纯化的AHL中。群体诱导导致GFP表达升高，检测限在纳摩尔范围内。

图3. ILM检测病原体信号，并通过工程遗传回路释放治疗有效载荷。

ILM在体内治疗植入物相关感染

我们评估了ILM在体内治疗假体周围关节感染的应用。该模型旨在捕捉早期植入后感染，在此期间，大多数感染发生在临床环境中。通过将不锈钢假体植入股骨髓内管并将ILM固定在植入物的远端以将其定位在关节空间内，建立了小鼠模型（图4A和B）。为了评估细菌的控制能力，我们测量了植入后Ecc扩散到周围组织中的情况。1天后，在ILM附近的组织中没有检测到Ecc，而在没有PVA支架的情况下，细菌会逃逸（图 4C).接下来，我们评估了长期安全性和稳定性。在一周的时间里，小鼠的体重逐渐恢复，与典型的术后恢复一致。在植入后第1、3和7天，在假体周围组织、假体装置、肝脏或脾脏中未发现可检测到的Ecc。尽管有有效的生物控制，ILM仍支持包封的Ecc生长至饱和，并保持其在体内的存活率。为了测试工程遗传回路在植入后是否仍然有效，我们从外植的ILM中分离出携带群体感应质粒的Ecc。在体内7天后，在没有抗生素选择的情况下，大量回收的菌落保留了工程质粒。在AHL诱导后，所有>100个测试分离物均显示出强烈的GFP表达（图 4E），确认传感器功能在体内得以保留。我们通过量化ILM对外源诱导剂给药和铜绿假单胞菌感染的反应，进一步验证了体内自主感知。