来源：中国棉花

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为强化农作物种子监管，维护市场公平竞争秩序，严厉打击品种套牌侵权等行为，依据我国种子法规的有关规定，结合团队长期开展棉花分子检测工作的实践，修订完成农业行业标准《棉花品种真实性鉴定SSR分子标记》（NY/T 2634－2022）。该标准的发布实施将在净化我国棉种市场、保护品种创新等种业振兴行动上发挥重要作用。

标准修订背景

2014年发布的行业标准NY/T 2634－2014《棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法》主要存在如下问题：（1）标准的适用范围有限，仅限于陆地棉品种简单重复序列（simple sequence repeat, SSR）两两比对鉴定，不适用于海岛棉品种及多样品比对鉴定；（2）关于聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR），“7.3 PCR扩增”所述的39对SSR核心引物与“附录A”引物表提供的38对引物信息前后不一致，且采用的引物均是在棉花参考基因组发布前从公共数据库筛选获得的传统SSR引物，因不同来源的SSR引物开发标准不同、基因组背景信息不清楚，导致引物质量参差不齐，不利于检测技术体系与DNA指纹数据采集分析的标准化；（3）该标准仅提供了基于聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）平台的检测方法，不能满足真实性鉴定与DNA指纹数据库构建对标准化、数字化高精度检测的需求。

标准修订内容概要

2022版标准为NY/T 2634－2014《棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法》的修订版，在使用中代替NY/T 2634－2014。与NY/T 2634－2014相比，2022版标准除编辑性修改外，主要技术变化表现在：调整了“范围”“规范性引用文件”“术语和定义”“引物”“等位变异扩增片段信息”“仪器、设备和溶液配制”“检测程序”；增加了“检测方案”“鉴定意见”“结果报告”“参照样品名单”“引物分组信息”。

2022版标准调整内容

2022版标准明确将海岛棉纳入标准适用范围，解决了海岛棉品种缺乏统一分子鉴定标准的问题，使标准成为覆盖我国主要栽培棉种的通用技术法规，行业适用性更强。同时，在“真实性验证”之外，特别增加了“品种真实性身份鉴定”这一应用场景，使标准能够更精准地服务于品种权保护（验证）、种子市场监管（验证）和育种过程管理（身份鉴定）等不同需求，法律和技术应用针对性更强。

“规范性引用文件”增加了GB/T 3543.1《农作物种子检验规程总则》和GB/T 3543.5《农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定》，标志着SSR分子标记法不再是独立于传统检验方法之外的“新事物”，而是被正式纳入国家法定的农作物种子检验标准体系。

“术语和定义”部分增加了品种真实性身份鉴定、参照样品和引物组合信息，删除了SSR分子标记和带型的定义，使标准文本更加简洁、专业。

2022版标准“引物”序列全部重新设计，对于每个SSR引物，2022版标准不仅提供了序列，还给出了该位点在参照样品中的等位变异扩增片段范围（以碱基对bp表示）；增加了SSR引物的“等位变异扩增片段信息”，明确列出了用于确定上述“等位变异扩增片段信息”的1组“参照样品名单”，可实现跨平台、跨实验室数据校准和比对。

在“检测方案”部分增加了多重毛细管电泳方法，样品可以混合检测和单个个体检测，与之相配地增加了多重毛细管电泳时“引物分组信息”，可大幅降低单样本检测成本和时间，使大范围、高通量的品种筛查和数据库建设成为可能。

“仪器设备、试剂和溶液配制”中增加了DNA分析仪和毛细管电泳试剂。

“检测程序”中详细规定了DNA提取、毛细管电泳、数据分析的全流程方法，提供了从样品准备到原始数据的标准化操作流程，确保不同操作员、不同实验室都能按照同一套高标准的程序执行，可以极大提高结果的可重复性。

最后，2022版标准增加了“鉴定意见”和“结果报告”，规范的报告格式可极大增强检测报告作为法律证据的严肃性、规范性和抗质疑能力。

2022版标准核心参数试验验证与解析

◆ SSR引物筛选策略与特性

引物质量是标准研制的核心要素，优异的引物可以直接解决指纹采集与数据分析中的各种疑难问题。项目组基于48份代表性棉花基础种质10×重测序数据，通过生物信息学手段，全基因组挖掘了26626个具有单拷贝特性的SSR位点，其中，5712个位点适合开发为SSR引物，经过重测序数据评估，筛选出1246对多态性较高的引物。基于PAGE与毛细管电泳平台，采用初筛＋复筛的实验室分步筛选策略，利用395份棉花核心种质和12套三联体（父本＋母本＋F1）对初筛入选的候选SSR引物进行进一步筛选与评价。通过充分评估引物多态性、稳定性、数据统计难易、染色体上分布情况、多态信息含量（polymorphism information content, PIC）、连锁性、不对称扩增、品种鉴别能力等因素，遴选了一套高质量的单拷贝SSR引物。其应用可显著提高扩增质量与检测效率，实现了多倍体作物基因分型二倍体化。

按NY/T 2634－2014从公共数据库筛选的传统SSR引物，会因不同来源的引物开发标准不同、基因组背景信息不清楚、引物质量参差不齐，不利于检测技术体系的标准化。项目组在2022版标准引物开发设计时，将所有引物的Tm值均设置为60 ℃，便于不同引物扩增体系统一标准化，利于多重PCR检测，最终入选的60对CCRI系列引物均匀分布于棉花At、Dt组染色体；引物峰型清晰稳定、好判读；平均PIC值为0.48，共包含280个等位变异。60对SSR引物详细信息可在食典通-食品安全标准免费下载网（https://www.sdtdata.com/fx/fcv1/tsLibIndex）查询下载。

◆ 样品数量的试验确定

农作物品种作为一个遗传群体，品种内不同个体遗传背景不可能完全一致。对于真实性鉴定项目，检测样品数量须代表品种100%的遗传变异。棉花作为常异花授粉作物，遗传背景相对复杂，品种更难以实现高度纯合。因此，如何科学高效获取能反映棉花品种全部遗传变异的合理数量的样品非常关键。项目组选用32个不同纯度的棉花主栽品种进行了混合样品数量梯度测试试验，每个品种随机取10粒、30粒、50粒、70粒、90粒、120粒种子，分别制备混样DNA，使用60对SSR标记检测分析各品种6个混合梯度的电泳条带特点。结果表明，纯度较好的样品，6个梯度的混样DNA电泳条带一致；纯度较差的样品，30粒混样的DNA能包含样品所有等位变异；混合样品≥70粒时，检测样品各种等位变异占比趋于稳定。因此，2022版标准中规定试验样品应至少含有70个个体，混合检测或单个个体检测。而旧标准须通过分析每个样品的12个单粒种子SSR等位变异确定其基因型。

◆DNA提取质量要求

作为推荐性标准，明确凡是适合检测目的，都可以选择使用。2022版标准规定在DNA提取时，可以使用十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate, SDS）法、十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB）法或其他满足条件的试剂盒法；DNA的质量和数量应符合PCR扩增的要求，DNA无降解，溶液的紫外光吸光度OD260与OD280的比值宜在1.7～2.0。

◆PCR扩增

引物开发设计时，所有引物的Tm值均设置为60℃，所以PCR扩增程序中退火温度都是60 ℃，便于统一。另外，为了使检测结果的信号强弱相对一致，DNA模板终质量浓度应在6.0 ng·μL-1，可根据DNA质量浓度调整DNA模板体积。

◆ 电泳检测

在电泳检测平台中，2022版标准推荐了可供选用的荧光毛细管电泳平台和变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳平台，而旧标准仅推荐了变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳平台。按照2022版标准附录C推荐的SSR引物四色荧光分组方案，使用荧光毛细管电泳平台检测，60个引物分成6组进行电泳，每组可同时检测10对引物，检测效率提高了10倍。

◆ 阈值设定

不同品种差异位点数的判别需要建立在大量样品的测试与统计分析基础上。项目组使用60个标记检测了361份棉花常规种，利用DNA指纹数据库管理系统分析了361份样品两两之间的差异位点数（共65341个组）。结果显示：差异位点数在0～2的共有98组，占0.15%，其中包括23组同名品种和近似品种；差异位点数在3～5的共有595组，占0.91%；差异位点数在6～10的共有5099组，占7.8%；差异位点数在11～20的共有43209组，占66.1%；差异位点数在21～30的共有16340组，占25%。

此外，使用这60个标记检测72份杂交种，利用DNA指纹数据库管理系统分析了72份样品两两之间的差异位点数（共2485组）。差异位点数在0～2的共有23组，占0.93%，其中包括16组同名品种；差异位点数在3～5的共有1组，占0.04%；差异位点数在6～10的共有28组，占1.1%；差异位点数在11～20的共有1946组，占78.3%；差异位点数在21～30的共有487组，占19.6%。

综上所述，超过99%的棉花品种两两之间的差异位点均在3个以上。同时，项目组以往的研究发现，同一品种由于不同来源的生态条件差异与不同年份的世代差异导致的品种内遗传变异均在2个差异位点以下。因此，2022版标准将≥3个差异位点作为不同品种的判别阈值。该阈值设定与玉米、小麦、水稻、大豆、向日葵、甜瓜、黄瓜等作物标准一致。

标准应用场景

农业行业标准《棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法》（NY/T 2634－2022）经农业农村部批准发布（农业农村部公告第618号），自2023年3月1日实施。在农业农村部种业管理司与全国农业技术推广服务中心的大力支持下，项目组利用标准技术体系已构建了国内首个、规模最大的国家级棉花标准样品DNA指纹数据库，涵盖了我国1996－2023年1304份国家审定与省级审定棉花品种及588份新品种保护标准样品的DNA指纹数据。基于此，依托中国农业科学院棉花研究所建设的农业农村部棉花品质检验测试中心，2023年7月通过河南省农业农村厅组织的农作物种子质量检验机构资格复查与扩项评审，成为河南省首家部级农作物种业打假维权检验机构，也是我国棉花种业领域第1家获得棉花品种真实性分子检测资质的部级农作物种子质量检验机构。

截至目前，2022版标准方法已成为新疆维吾尔自治区转基因抗虫棉、非转基因棉、联合体等品种区试试验、自治区优良棉花品种筛选展示项目、新疆生产建设兵团棉花推荐品种身份数据库建设等品种审定与种子市场监管领域指定的技术方法，已累计为棉种企业、科研院所、棉纺企业等提供分子检测技术服务1500余批次，为保障广大棉农用种安全，推动我国棉花种业高质量发展提供了有力技术支撑。

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中国棉花，2026，53（3）：44-47.

https://doi.org/10.11963/cc20250144

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