Cell丨肿瘤内微生物研究再次大打折扣——肿瘤微生物组的真实分布与多界生命景观|宿主|微环境|微生物研究|特异性|细菌|肿瘤

撰文丨易

长期以来，微生物被认为是肿瘤微环境的重要组成部分，但关于其在各种癌症类型中普遍存在的程度，研究结论相互矛盾（）。此前利用大规模肿瘤测序数据集（如TCGA、UK 100kGP）进行的泛癌调查，因存在序列错误分类、样本污染、批次效应和缺乏阴性对照等问题，导致对肿瘤内真实微生物群落的存在、分布和特异性产生了显著不确定性（）。虽然已有明确证据表明某些微生物（如HPV、EBV、幽门螺杆菌、具核梭杆菌）与特定部位的癌症（如头颈部癌、胃癌、结直肠癌）密切相关，但关于非屏障组织部位（如脑、乳腺等）癌症是否存在微生物定植，学界仍无定论。因此，迫切需要一种更严谨、强大的方法来区分真正的肿瘤相关微生物信号与假阳性结果，从而为癌症微生物组提供一个高分辨率、可靠的图谱。

近日，美国丹娜—法伯癌症研究所Matthew Meyerson和Anders B. Dohlman在Cell期刊上发表题为Biodiversity and biogeography of the multi-kingdom cancer microbiome的研究论文，通过开发高精度的宿主序列扣除与去污染分析流程，对大规模肿瘤基因组数据进行分析，发现在严格去污染后，大多数癌症类型缺乏可检测的特异性微生物组，但口腔消化道肿瘤中存在复杂多样的多界微生物群落，并且其定植水平与肿瘤突变负荷显著正相关。

研究团队首先构建并严格验证了一个名为PathSeq-T2T的创新性生物信息学流程，其核心是利用完整的端粒到端粒人类参考基因组（T2T-CHM13）对肿瘤全基因组测序数据进行精细化宿主序列扣除。这一步骤至关重要，因为早期研究的争议很大程度上源于未能有效区分人类序列与低生物量样本中微弱的微生物信号。为了验证其效能，研究团队先进行了计算机模拟混合实验，将已知微生物与人类序列按梯度稀释混合，结果证明PathSeq-T2T在极端稀释条件下（微生物与宿主比例低至1:10）仍能近乎完全去除宿主序列，并准确识别单个微生物读长，其性能显著优于仅使用标准人类基因组参考的既往方法。随后，为了模拟现实实验中的复杂性，研究团队进行了体外混合实验，将提取的微生物与人类DNA按相同梯度物理混合并测序。这一关键步骤揭示出，尽管PathSeq-T2T能有效分离目标微生物，但所有样本，包括阴性对照，都普遍存在源于实验室试剂、环境或样本处理的背景污染微生物（如痤疮皮肤杆菌）。此发现不仅确认了背景污染的普遍性，还能够量化污染水平，从而为后续的真实肿瘤数据分析设定了严格的去污染阈值（0.1 RPM）。

在完成方法学验证后，研究团队将此优化流程应用于来自英国10万人基因组计划的16,369个高深度肿瘤全基因组及其匹配的胚系样本，以绘制泛癌微生物图谱。为了从海量数据中区分真正的肿瘤定植菌与普遍存在的污染物，团队创新性地提出了“泛癌等流行评分”（PCE），用于量化每个微生物物种在不同癌症类型中分布的均匀度。应用此去污策略后，一个清晰的模式得以浮现：绝大多数癌症类型（如脑瘤、肉瘤）在经过严格去污后，其微生物信号降至背景水平以下，表明这些肿瘤中缺乏可检测的、特异性的微生物群落。然而，一个显著的例外是口腔消化道癌症（包括结直肠、口咽、食管和胃癌），结果显示这些肿瘤内部存在丰富、复杂且多样化的多界微生物生态系统，不仅包含已知的细菌，还首次在部分口咽癌和结直肠癌中系统地检测到了真菌、古菌、病毒以及原生动物寄生虫毛滴虫的DNA序列，描绘了一幅前所未有的、多界生命共存的肿瘤微环境图景。进一步分析其生物地理学特征，发现这些微生物群落的组成具有强烈的解剖部位特异性，例如口腔癌以普雷沃菌、链球菌为主，而结直肠癌则以拟杆菌、梭杆菌为特征，完美复现了健康消化道的微生物梯度分布。

在成功刻画微生物组的分布与构成后，研究团队深入探究了其与宿主肿瘤生物学特性的关联。通过对结直肠癌的深入剖析，首先发现，具有高突变负荷的基因亚型，即微卫星不稳定型（MSI）和DNA聚合酶ε/δ突变型（POLE/POLD1），其肿瘤内的微生物载量（尤其是细菌）显著高于微卫星稳定型（MSS）肿瘤。随后，为了厘清这种关联的本质，利用肿瘤突变负荷（TMB）这一连续变量进行相关性分析，结果得到了一个更普适的规律：无论是在MSI还是MSS亚型内部，TMB与微生物载量均呈现显著的正相关。这一发现促使研究团队提出假设：微生物的富集可能直接与高突变负荷的基因组状态相关，而非特定DNA修复缺陷通路所独有。为了验证这一点，研究团队构建了多元统计模型，结果表明，在将TMB作为协变量纳入模型后，MSI或聚合酶突变亚型本身对微生物载量的独立预测作用消失了，而TMB和肿瘤解剖部位则成为最强的预测因子。这意味着，肿瘤基因组的不稳定性本身创造了一个更利于微生物定植或生存的微环境。这一关联在另一独立队列（TCGA）的结直肠癌和胃癌数据中得到了验证，进一步证实了其稳健性。最后，对具体微生物物种的分析显示，某些与高TMB相关的物种（如具核梭杆菌、脆弱拟杆菌）本身具有促炎或基因毒性潜能，而一些具有抗炎作用的共生菌（如普通拟杆菌、普拉梭菌）则在低TMB肿瘤中更丰富，暗示了微生物功能与肿瘤基因组背景之间可能存在的功能性互作。