【写在前面】：本期推荐的是由上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所、上海中医药大学附属曙光医院中西医结合外科研究所等研究团队合作近期发表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示扶正化瘀方可能通过抑制Gli1通路减轻导管反应和肝纤维化。
【期刊简介】
【题目及作者信息】
Fuzheng Huayu formula attenuates ductular reaction and liver fibrosis potentially through suppressing Gli1 pathway
民族药理学相关性
扶正化瘀方（FZHY）临床上用于治疗肝纤维化，但其药理机制尚不完全清楚。
目的
探讨扶正化瘀方的抗纤维化作用，尤其是对胆汁淤积性肝纤维化的疗效，以及其潜在的分子机制。
方法
采用Mdr2基因敲除小鼠和CCl₄/2-AAF诱导的肝纤维化模型大鼠评估扶正化瘀方的治疗潜力，并以Gli1抑制剂GANT61作为阳性对照药物。通过组织学分析和双免疫荧光技术检测扶正化瘀方对导管反应和肝纤维化的影响。体外实验中，使用肝祖细胞系WB-F344细胞，转导过表达Gli1的慢病毒载体，并用丁酸钠诱导分化，以验证扶正化瘀方的作用机制。
结果
在Mdr2小鼠和CCl₄/2-AAF诱导的大鼠模型中，扶正化瘀方能明显改善肝纤维化，表现为胶原沉积减少、肝脏羟脯氨酸含量降低以及炎性细胞浸润减轻。扶正化瘀方降低了Epcam、CK19和CK7的表达。双免疫荧光显示，CCl₄/2-AAF大鼠中CK19⁺和OV6⁺细胞数量增多，而扶正化瘀方治疗后减少。机制上，扶正化瘀方下调了肝脏中Gli1的表达。值得注意的是，在CCl₄/2-AAF诱导的大鼠中，扶正化瘀方对导管反应和肝纤维化的抑制作用与Gli1抑制剂GANT61相似。体外实验中，扶正化瘀方对WB-F344细胞向胆管表型分化的抑制作用也与GANT61相似。此外，过表达Gli1的慢病毒转染实验证实，扶正化瘀方以Gli1依赖性方式抑制WB-F344细胞向导管表型分化。
结论
扶正化瘀方具有显著的抗纤维化作用，其机制可能通过抑制Gli1通路，从而抑制肝祖细胞向导管表型分化。这一发现为扶正化瘀方的作用机制提供了新的见解，并提示Gli1信号通路可能在其抗纤维化作用中发挥重要作用。
图文摘要
【前言】
肝纤维化是一种以细胞外基质过度积聚和纤维瘢痕形成为特征的进行性病理状态，常继发于病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病和自身免疫性肝炎等慢性肝病，构成重大的全球性健康挑战。若不及时干预，肝纤维化最终会进展为肝硬化和肝细胞癌。肝纤维化的程度与多种肝脏疾病的死亡率直接相关。流行病学证据表明，肝硬化占全球年死亡率的2.4%，其中中国占全球肝硬化相关死亡病例的14.9%。由于如此沉重的疾病负担，肝纤维化的临床治疗仍然是一项艰巨的任务。值得注意的是，临床前研究和动物模型已经证实，纤维化病变具有潜在的可逆性，即使在早期肝硬化阶段也是如此。这些发现为制定针对性的治疗策略奠定了坚实的科学基础。然而，尽管研究力度很大，迄今尚无抗纤维化药物获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，这凸显了有效治疗干预措施的迫切需求。
导管反应是一种见于多种肝脏疾病的组织学特征，表现为反应性导管细胞的增生，同时伴有炎性细胞浸润、汇管区水肿和纤维化。由于损伤刺激的多样性，导管反应中导管细胞的来源可以是肝祖细胞（HPC）、胆管细胞或肝细胞。在我们既往的工作中，发现原发性胆汁性胆管炎（PBC）、乙型肝炎病毒（HBV）感染和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者中CK19⁺导管细胞的积聚与胶原面积和α-SMA面积均呈正相关。同时，我们的研究证明，来源于HPC的导管反应在多种啮齿动物模型中显著促进肝纤维化的进展，包括四氯化碳（CCl₄）联合2-乙酰氨基芴（2-AAF）诱导的大鼠、胆管结扎诱导的大鼠、多药耐药基因2敲除小鼠（Mdr2⁻/⁻小鼠）以及CCl₄联合西方饮食诱导的小鼠。导管反应细胞倾向于分泌一系列促炎和促纤维化细胞因子，如转化生长因子β1（TGFβ1）、TGFβ2、白细胞介素-6、血小板源性生长因子和趋化因子2。这些细胞因子的分泌促进汇管区成纤维细胞和肝星状细胞（HSC）的活化，导致巨噬细胞和中性粒细胞的积聚，从而启动或促进肝纤维化过程。
神经胶质瘤相关癌基因同源物（Gli）家族是最早发现与人类疾病相关的发育调控基因之一，是经典和非经典Hedgehog（Hh）信号通路的末端效应转录因子，包括Gli1、Gli2和Gli3。其中，Gli1具有五个保守的锌指DNA结合结构域，使其能够与其靶基因的启动子区域相互作用。Gli1的异常激活与细胞增殖和分化过程的失调密切相关。值得注意的是，这种异常激活与器官纤维化的发生和进展密切相关。我们前期的研究证实，在肝纤维化进展过程中，Gli1在促进来源于HPC的导管反应中发挥关键作用。在刺激多能干细胞分化为导管表型的模型中，已发现细胞角蛋白19（CK19）和CK7的启动子区域包含Gli1的特异性结合序列，表明它们是Gli1促进导管细胞增殖的直接靶点。基于这些发现，阻断HPC来源的导管反应中Gli1的激活，成为极具前景的抗肝纤维化治疗方向。
中医药在中国治疗肝纤维化有着悠久的历史。根据中医理论，肝纤维化的病机常以“正气亏虚、瘀血内阻”为特征。因此，治疗原则强调扶助正气、活血化瘀，这一策略与扶正化瘀方（FZHY）的组方思路高度一致。扶正化瘀方由丹参（8克）、虫草（4克）、桃仁（2克）、绞股蓝（6克）、五味子（2克）和松花粉（2克）组成。由于该方在肝纤维化和肝硬化患者中具有显著的临床疗效，已获得中国国家食品药品监督管理局批准（批准文号：Z20050546）。此外，其疗效已在美国FDA针对慢性丙型肝炎患者的Ⅱ期临床试验中得到进一步验证。然而，扶正化瘀方作用于肝祖细胞的具体机制尚不清楚，急需阐明。
本研究旨在两种体内模型（CCl₄联合2-AAF诱导的大鼠和Mdr2⁻/⁻小鼠）以及丁酸钠（SB）诱导HPC分化的体外模型中，探讨扶正化瘀方的药理作用。我们的研究结果有力地证明，扶正化瘀方可能通过抑制Gli1通路，从而抑制HPC向导管表型分化，进而减轻肝纤维化。
【结果部分】
1. 扶正化瘀方改善Mdr2⁻/⁻小鼠的胆汁淤积性肝纤维化。
图 2. 扶正化瘀方改善 Mdr2⁻/⁻ 小鼠的胆汁淤积性肝纤维化。A. 肝脏连续切片代表性图像：H&E 染色（200×）、天狼星红染色（100×）、α-SMA 和 F4/80 免疫组织化学染色（200×）。B. 血清 ALT 含量（n = 6）。C. 血清 AST 含量（n = 6）。D. 天狼星红阳性面积百分比形态计量学分析（n = 6）。E. 羟脯氨酸含量（n = 6）。F. Acta2 和 Col-I 的 mRNA 表达（n = 6）。G. α-SMA 的蛋白免疫印迹及灰度值分析（n = 3）。与野生型对照组相比，∗P < 0.05，∗∗P < 0.01；与 Mdr2⁻/⁻ 组相比， < 0.05，# < 0.01。WT：野生型组；Mdr2⁻/⁻：Mdr2 基因敲除组；FZHY：扶正化瘀方治疗组；OCA：奥贝胆酸治疗组
2. 扶正化瘀方减轻CCl₄联合2-AAF诱导的大鼠肝纤维化。
图 3. 扶正化瘀方减轻 CCl₄ 联合 2-AAF 诱导的大鼠肝纤维化。A. 肝脏连续切片代表性图像：H&E 染色（200×）、天狼星红染色（100×）、以及 Col-Ⅰ 和 α-SMA 免疫组织化学染色（200×）。B. 血清 ALT 含量（n = 5）。C. 血清 AST 含量（n = 5）。D. 天狼星红阳性面积百分比形态计量学分析（n = 5）。E ∼ G. Acta2、Col-I、Col-III 和 Col-IV 的相对 mRNA 表达量（n = 5）。H. α-SMA 的蛋白免疫印迹及灰度值分析（n = 3）。与对照组相比，∗P < 0.05，∗∗P < 0.01；与 CCl₄/2-AAF 组相比， < 0.05，##P < 0.01。Oil：对照组；CCl₄/2-AAF：四氯化碳联合 2-乙酰氨基芴处理组；FZHY：扶正化瘀方治疗组；GANT61：GANT61 治疗组。
3. 扶正化瘀方抑制纤维化环境中的导管反应。
图 4. 扶正化瘀方抑制 Mdr2⁻/⁻ 小鼠中的导管反应。A. Epcam、CK7 和 CK19 免疫组织化学染色代表性图像（200×）。B. Krt19、Epcam 和 Krt7 的相对 mRNA 表达量（n = 6）。C. CK19 的蛋白免疫印迹及灰度值分析（n = 3）。与野生型对照组相比，∗P < 0.05，∗∗P < 0.01；与 Mdr2⁻/⁻ 组相比， < 0.05，# < 0.01。WT：野生型组；Mdr2⁻/⁻：Mdr2 基因敲除组；FZHY：扶正化瘀方治疗组；OCA：奥贝胆酸治疗组。
图 5. 扶正化瘀方抑制 CCl₄/2-AAF 诱导的大鼠中的导管反应。A. OV6、Epcam、CK19 和 CK7 免疫组织化学染色代表性图像（200×）。B. CK19（红色）与 OV6（绿色）共染色的共聚焦分析（200×）。C. Krt19、Epcam 和 Krt7 的相对 mRNA 表达量（n = 5）。D. CK19 的蛋白免疫印迹及灰度值分析（n = 3）。与对照组相比，∗P < 0.05，∗∗P < 0.01；与 CCl₄/2-AAF 组相比， < 0.05，# < 0.01。Oil：对照组；CCl₄/2-AAF：四氯化碳联合 2-乙酰氨基芴处理组；FZHY：扶正化瘀方治疗组；GANT61：GANT61 治疗组。
4. 扶正化瘀方在纤维化模型中抑制Hedgehog信号通路。
图 6. 扶正化瘀方减轻纤维化动物模型中 Hedgehog 通路的激活。A. Mdr2⁻/⁻ 小鼠中 Dhh、Shh、Ihh、Smo、Ptch1、Ptch2、Gli1 和 Gli2 的 mRNA 表达量（n = 6）。B. Gli1 的蛋白免疫印迹及灰度值分析（n = 3）。C. CCl₄/2-AAF 诱导的大鼠中 Dhh、Ihh、Shh、Ptch1、Ptch2、Smo、Gli1、Gli2 和 Gli3 的相对 mRNA 表达量（n = 5）。与对照组相比，∗P < 0.05，∗∗P < 0.01；与 CCl₄/2-AAF 组或 Mdr2⁻/⁻ 组相比， < 0.05，# < 0.01。WT：野生型组；Mdr2⁻/⁻：Mdr2 基因敲除组；FZHY：扶正化瘀方治疗组；OCA：奥贝胆酸治疗组。Oil：对照组；CCl₄/2-AAF：四氯化碳联合 2-乙酰氨基芴处理组；FZHY：扶正化瘀方治疗组；GANT61：GANT61 治疗组。
5.扶正化瘀方在体外抑制了肝祖细胞向胆管细胞的分化及扶正化瘀方以Gli1依赖的方式减轻了导管反应。
图 7. 扶正化瘀方在体外抑制肝祖细胞向胆管细胞的分化。A. 扶正化瘀方对 WB-F344 细胞的细胞活力影响。B. Krt19 和 Krt7 的 mRNA 表达量（n = 3）。C. CK19 的蛋白免疫印迹及灰度值分析（n = 3）。D. Dhh、Smo、Ptch2、Gli1 和 Gli2 的 mRNA 表达量（n = 3）。E. Krt19、Krt7 和 Gli1 的 mRNA 表达量（n = 3）。F. WB-F344 细胞经 CK19 染色的代表性荧光图像（600×）。G. CK19 的蛋白免疫印迹及灰度值分析（n = 3）。H. Krt19 和 Gli1 的 mRNA 表达量（n = 3）。与对照组相比，∗P < 0.05，∗∗P < 0.01；与 SB 诱导模型组相比， < 0.05，# < 0.01；与扶正化瘀方低剂量组相比，△P < 0.05，△△P < 0.01。a：与 OE-Neg 组相比，P < 0.05；b：与 OE-Gli1 组相比，P < 0.05；c：与 SB + OE-Gli1 组相比，P < 0.05；d：与 SB + OE-Neg 组相比，P < 0.05。
【结论与讨论】
总之，我们最近的研究提供了进一步的证据，支持扶正化瘀方（FZHY）对肝纤维化（包括胆汁性纤维化）的治疗效果。我们的研究首次表明，扶正化瘀方的抗纤维化机制涉及抑制肝祖细胞（HPC）向导管表型分化，且这一作用似乎与抑制Gli1信号通路相关。
注：本文原创表明为原创编译，非声张版权，侵删！
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