镁基普鲁士蓝借恢复 HIF-1α 信号传导、抑铁死亡改善骨关节炎|世界关节炎日|大鼠|普鲁士蓝|滑膜|炎症|细胞|骨关节炎

骨关节炎 (OA) 是一种退行性关节疾病，由机械应力、炎症和代谢失调之间复杂的相互作用驱动。由于疗效和安全性问题，目前的临床治疗仍不令人满意，并且对关键病理机制的探索较少。在本文，作者团队开发了富含镁的普鲁士蓝纳米药物（MgPB），它可以有效地隔离亚铁过载，以维持HIF-1α并抑制软骨细胞铁死亡。这项研究强调，铁死亡和HIF-1α降解在OA进展过程中形成自我放大的恶性循环。这些发现为OA发病机制提供了有意义的机制见解，从而为OA提供了一种有前途且有效的治疗方法。

1.铁死亡和HIF-1α调节OA患者的人类软骨细胞

在OA患者中，膝关节内侧软骨通常比外侧膝关节软骨表现出更严重的退化和损伤。作者团队收集了外侧软骨健康（指定为健康侧软骨（HSC））和内侧患有骨关节炎（指定为骨关节炎侧软骨（OSC））的人类膝关节组织（图1a）。H&E以及SOFG的实验染色显示，在OSC组中，股骨和胫骨软骨均表现出显着的病理特征，包括变薄、表面粗糙、破碎、胶原纤维排列紊乱和糖胺聚糖含量减少（图1b）。免疫组化的结果表明OSC组的HIF-1α表达降低，即软骨内生理缺氧环境被破坏（图1c）。OSC组也表现了铁死亡的病理激活（图1d）。

这些结果表明，亚铁下垂和缺氧诱导因子-1α能有效地调节软骨细胞的微环境。同时抑制铁下垂和恢复缺氧诱导因子-1α信号是治疗骨性关节炎的有效策略。

2.MgPB纳米粒子的合成与表征

MgPB是通过聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Mw = 6 kDa）空间限制下的简单自组装方法合成的。通过透析和冻干纯化后，获得浅绿色的MgPB粉末（图2a）。将 MgPB重悬于盐水或PBS中至所需浓度备用。透射电子显微镜 (TEM) 显示 MgPB具有典型的均匀立方形貌（图2b）。Zetasizer测量表明，水溶液中的MgPB 的流体动力学直径为140.5±1.2 nm，多分散指数为0.135（图2c）。能量色散X 射线光谱 (EDS) 分析证实了纳米颗粒内铁和镁元素的均匀分布（图2d）。高分辨率 TEM 揭晓MgPB的晶格条纹（图2e）和电子衍射图（图 2f）。此外，傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 证实了金属氰化物结构的存在（图2g）。X射线光电子能谱 (XPS) 分析证实 MgPB 粉末中存在 C、N、O、Fe 和 Mg 元素（图 2h）。这些表征结果表明，MgPB 在体外和体内都能实现稳定的Fe2+螯合和抗氧化活性。

3.细胞OA模型的体外建立及MgPB治疗研究

接下来，我们建立体外环境来模拟OA病理学和MgPB治疗。我们采用来自 SD大鼠的原代软骨细胞，在常氧 (20% O2) 下培养，并用Erastin处理以激活铁死亡和IL-1β以诱导炎症（图3a）。我们使用免疫荧光染色系统地评估了不同处理条件下的细胞内ROS水平（DCF）（图3b，c）、LIP（图3d）、缺氧环境（HIF-1α）表达（图3e）、细胞凋亡（PI染色）（图3f）和软骨细胞基质成分（COL2A1和Aggrecan）（图3g）。

CCK-8增殖测定表明，在低于1600 µgmL−1的研究浓度下，MgPB对软骨细胞没有表现出细胞毒性（图3h），这表明其具有生物相容性。用FITC标记的MgPB处理1小时后，软骨细胞显示出广泛的FITC阳性率，证明MgPB的有效细胞内化（图3i）。此外，当仅用特定铁死亡抑制剂Ferrostatin-1处理的OA软骨细胞时，还观察到HIF-1α降解的部分减轻，表明病理性铁死亡本质上导致OA微环境中HIF-1α降解加剧的单向联系。

4.MgPB抑制软骨细胞铁死亡以治疗OA

MgPB的铁螯合能力可以有效清除软骨细胞的铁过载，防止OA病理学软骨细胞的铁死亡。我们利用IF系统评估了铁死亡相关标志物。结果表明，缺氧组表现出 ROS (DCF)、Fe2+和LIP积累最低，同时抗铁死亡标记物SLC7A11表达最高（图4a-e）。此外，生化测定证实MgPB有效抑制脂质过氧化产物MDA并恢复系统Xc−、NADPH和GSH的水平，显着优 IH、DF 和单独的Mg2+治疗（图 4g）。扫描电子显微镜 (SEM) 图像直观地显示OA组中明显的软骨细胞铁死亡，其特征是线粒体膜完整性破坏、嵴破裂和体积缩小（图4h）。传统的单途径干预措施（例 IH、DFO）的长期疗效有限，因为会补偿性地加剧疾病进展。这种深刻的机制明确表明了MgPB中双靶向策略的必要性和优越性，该策略同时恢复HIF-1α信号传导并抑制铁死亡，从而决定性地打破这种病理循环（图4i）。

5.镁铅通过维持HIF-1α和抑制铁死亡减少软骨细胞死亡和恢复细胞外基质合成

为了系统地评估MgPB对OA的体外治疗效果，我们对HIF-1α/缺氧探针/PI/DAPI进行了四重免疫荧光染色，并对COL2A1和聚集蛋白聚糖进行了双重染色（图5a）。Western Blot（图5b）和RT-qPCR（图5c）结果进一步证实了潜在的ECM重塑机制，表明了其软骨保护的基线功效。相比之下，MgPB在所有干预组中表现出最显着的治疗效果。与OA组相比，MgPB明显降低了降解标记物ADAMTS5和MMP13。同时它将合成标志物聚集蛋白聚糖和COL2A1强劲上调至0.80和0.87，分别 OA组增加了2.76倍和3.22倍，非常接近缺氧组的生理稳态。

因此，MgPB的主要治疗功效从根本上依赖于与Fe2+的高结合亲和力和普鲁士蓝框架的高效阳离子交换能力。通过将结构性铁螯合能力与 Mg2+的功能性释放相结合，这种协同机制为逆转OA病理提供了全面且高效的策略。

6.MgPB减轻大鼠OA症状

基于MgPB在细胞OA模型中的体外研究，我们接下来评估了其体内治疗效果。体内荧光成像证实注射后48小时OA组大鼠关节腔内仍可检测到MgPB（图 6a、b）。然后每2天通过关节内注射施用治疗性 MgPB (40 mg/kg)。同时，HA阳性对照按照每周一次的标准临床方案进行给药，Sham组和OA组接受相应的盐水注射（图6c）。随后，进行足迹分析以直观地评估步态异常（图6d）。足迹分析表明，OA 会导致严重的步态异常，其特征是双侧后肢步幅异常增加。具体来说，OA大鼠异常的平均双侧后肢步长（15.34厘米）在MgPB治疗后最有效地减少至10.35厘米，与假手术组的健康基线非常相似（图6e）。然后进行机械异常性疼痛和热板潜伏期测试以评估膝关节疼痛的耐受性（图6f）。

最后，采用步态测试进一步获取多维动态参数，包括平均压力、推进时间和平均爪接触面积（图6g）。与上述实验表明在HA提供基线结构润滑的同时，MgPB介导的纳米疗法全面、更有效地恢复了动态步态参数，凸显了其在OA管理中的临床转化潜力。

7.MgPB通过将HIF-1α与ROS驱动的炎症解偶联来调节滑膜微环境并促进M2巨噬细胞极化

首先，我们分离了正常大鼠BMDM，并使用CCK-8测定评估了MgPB对它们活力的影响。随后，我们通过用来自OA表型软骨细胞的上清液培养这些细胞，建立了体外OA滑膜模型。免疫荧光染色（图7a-f）显示，OA微环境诱导HIF-1α上调，同时滑膜细胞中大量ROS积累。

为了在体内验证这些发现，对整个关节进行了全面的组织学评估。 H&E染色（图7g）表明，除了严重的软骨侵蚀外，OA组还表现出明显的滑膜病理，其特征是严重的滑膜增生、内衬层增厚和大量炎症细胞浸润。此外，滑膜组织的IHC染色（图7h-l）证实了MgPB强大的免疫调节功效。

8.MgPB治疗OA的组织学和机制研究

我们重点关注膝关节，经过实验发现MgPB组和Sham组表现出高度完整的软骨结构和形态，证实了MgPB组大鼠具有卓越的组织保护作用（图8a）。对大鼠软骨切片进行组织学染色。发现OA组的基质有大量损失（图8b，c）。更重要的是，平均OARSI评分从OA组的4.33降低至OA+MgPB组的0.83，代表OA病理的强劲缓解（图8d）。与WB结果一致，IHC染色证实MgPB治疗后HIF-1α、FTH1、GPX4和SLC7A11表达恢复（图8f，g）。给予MgPB后，OA组大鼠升高的Fe2+、Fe3+和MDA水平显着降低，而GSH水平和GSH/GSSG 比值恢复（图8h）。相反，MgPB治疗增加了关节空间并减少ROS积累（图8i，j）。

这些结果共同表明，与HA的物理润滑不同，MgPB可以主动有效地抑制铁死亡并维持HIF-1α表达，从而减少软骨细胞死亡，恢复ECM合成能力，最终缓解OA。

结论

总之，我们阐明了缺氧的破坏和铁死亡的诱导是临床OA患者软骨细胞的两个关键标志。针对这两个特点合成了具有突出的铁螯合和抗氧化性能的MgPB NPs。诸多研究表明，MgPB可以通过恢复HIF-1α信号传导以及抑制铁死亡来缓解 OA 症状，也能有效地重新编程滑膜免疫微环境，从而实现全面的全关节治疗。通过利用MgPB作为双靶向工程策略，我们成功实现了同时铁死亡抑制和 HIF-1α信号恢复，克服了单途径干预的局限性，并为OA提供了稳健的治疗范例。

在该研究中，研究人员使用了赛昂斯大小鼠步态行为分析系统（SANS，SA114）来进行实验操作。