导读
通过将非催化辅因子引入蛋白质骨架而构建的人工酶，正逐渐成为针对非天然反应的极具前景的生物催化剂。然而，由于复杂的细胞环境带来了诸多挑战，开发细胞内人工酶的构建策略及非天然催化功能具有较大的挑战，特别是在细胞内进行立体选择性生物合成的人工酶研究报道十分有限。因此，如何在细胞内构建含有非天然催化中心的人工酶并在体内实现其非天然不对称催化功能是当前面临的关键科学问题。近日，江南大学周志教授组联合厦门大学王斌举教授组在知名期刊Nature Communications上发表了题为“Intracellular assembly of artificial enzymes for cytoplasmic enantioselective Mannich reactions”的研究论文。该研究报道了一种基于蛋白与非天然催化辅因子共价修饰的人工酶细胞内高效构建策略。仅需将表达目标蛋白的细胞与人工辅因子进行短时间孵育，可实现含非天然催化中心人工酶的快速高效组装。体内成功组装的人工酶可高效催化一例不对称曼尼希反应，并在细胞内和体外高效合成非天然手性β-氨基酮。利用该策略，可通过全细胞催化循环系统实现了目标非天然手性含氮化合物的克级生产，从而展示了其在非天然生物合成中的应用潜力。这项工作建立了一种简单且具有普适性的人工酶体内构建方法，可利用多种生物支架和合成辅因子，在细胞内构建具有新型功能的人工酶，从而扩展了在细胞内进行定制化合成应用的生物酶元件库。
人工酶的设计与工程化代表了生物催化领域的一个变革性前沿，它融合了蛋白质设计、化学生物学、有机合成和定向进化的原理，以扩展自然界分子机器的催化能力。尽管在设计具有定制化体外反应性的人工酶方面已取得显著进展，但将这些系统应用于活细胞内进行多样化的非生物转化仍是一项艰巨的挑战，特别是对于需要严格立体控制的不对称转化而言。在细胞内构建人工酶面临的一个核心挑战，是如何将非生物催化辅因子高效且位点特异性地嵌入蛋白质的活性位点空腔中。在体外，通常采用共价键、供体和超分子策略，为蛋白质支架赋予非天然催化位点。然而，细胞内环境带来了额外的复杂性，因为竞争性的亲核试剂、氧化还原过程以及蛋白质稳态网络可能会影响辅因子的稳定性、蛋白质的折叠以及催化性能。
早期研究主要侧重于利用亲和锚定技术在细胞内组装人工金属酶（ArMs），以最大限度地减少细胞内环境的影响。将非天然氨基酸纳入酶设计，是构建细胞系统内人工酶的一种极具前景的策略。然而，工程化酶表达水平低、细胞内立体选择性受限以及催化活性下降等挑战很大程度上限制了该方法的应用范围。在细胞内设计人工酶时，共价修饰方法少有探索，因为共价修饰方法通常需要在纯化的酶。然而，在简便性和通用性方面，共价策略具有明显的优势。将其应用于人工酶的高效细胞内组装，可大幅拓宽可用于全细胞生物催化的酶类和催化反应的多样性。本文报道了一种通过共价锚定实现人工酶的细胞内组装的高效策略，与天然酶类似的方式，通过向携带多种蛋白质骨架的细胞中直接添加合成催化辅因子孵育，人工酶通过在细胞内与人工仲胺辅因子高效地形成共价二硫键构建而成，整个过程简单高效。
图1 人工酶的细胞内组装及非天然催化反应
先前作者曾报道过通过二硫键交换，将催化性仲胺辅因子（SA）共价嵌入纯化的 LmrR骨架口袋中，从而在体外构建了人工迈克尔酶 LmrR_SA。作者将携带 LmrR_Cys 蛋白的大肠杆菌与不同浓度的合成辅因子SA及不同反应时间进行孵育，研究合成辅因子 SA 与目标生物支架 LmrR 在细胞内的生物偶联效率，并发现细胞与合成辅因子SA孵育仅10分钟即可在细胞内高效构建完成目标人工酶。此后，作者设置环己酮与环状亚胺的Mannich反应为模板反应并使用细胞内构建的人工酶进行活性测试，携带蛋白LmrR_L57C_N88A的大肠杆菌的参与全细胞反应的初始活性与立体选择性最高（58% e.e.，9:1 d.r., 58% 产率），空白对照组证明目标蛋白与辅因子对高立体选择性的反应缺一不可。在测试其他蛋白骨架（Myoglobin，Nitrobindin）与纯酶活性验证后，作者确定LmrR_L57C_N88A_SA1（AM_57SA_2.0）为最佳起始蛋白以获得目标产物(R, S)-3a（73% e.e.，10:1 d.r., 98% 产率）。
图2 人工酶的体内和体外构建及催化的不对称反应
为进一步提高反应立体选择性，作者基于粗酶的筛选策略进行了定向进化，并验证合成的辅因子SA无需像传统共价人工酶进行复杂的预处理，可类似于天然辅因子磷酸吡哆醛（PLP）和硫胺素焦磷酸（ThDP）等，直接向粗酶液中加入如即可在反应体系中有效发挥作用。在经过三轮定向进化后，获得最优变体AM_57SA_5.0（96% e.e.，>20:1 d.r., >99% 产率），其催化效率约为(kcat/KM(imine))为AM_57SA_1.0的1.7倍，并且在全细胞反应条件下，反应保持了较好的立体选择性（90% e.e.，>20:1 d.r., >99%产率）。
图3 人工酶的定向进化
在确定了最优条件并获得了进化突变体后，我们分别在细胞内和体外条件下，研究了进化突变体AM_57SA_5.0介导的曼尼希反应的底物范围（图4）。环状亚胺的两个芳香环上的取代包括甲氧基、卤素、氰基和空间位阻较大的叔丁基等，无论在细胞内还是体外反应中均能被很好地容忍（3a-3s），但全细胞下的反应立体选择性均略低于纯酶反应结果。环状酮的结构特征显著影响反应的立体选择性和反应性。与4-氧代硫环戊烷（3t）和4,4-二甲基环己酮（3v）的反应保持了优异的对映体选择性和收率。
图 4 人工酶体内和体外催化不对称曼尼希反应底物谱考察
作者为验证在全细胞系统内高效构建人工酶所采用策略的有效性和实用性，在全细胞条件下，通过人工酶对手性曼尼希产物进行了半制备和克级制备合成。首先，在OD600=10的条件下，利用携带AM_57SA_5.0的大肠杆菌细胞对6种手性磺酰胺进行了半制备级别生物合成（30 mg），且具有良好的立体选择性。为了进一步说明设计的细胞内人工酶构建策略在非天然产物生物合成中的适用性，作者设计了一个全细胞催化循环系统，以实现非天然手性磺酰胺的克级生产，在800 mL体系中进行4次循环反应实现，最终，分离获得了1.06 g手性磺酰胺(R, S)-3a，其对映体选择性为90%，d.r.值>20:1，分离收率达97%。
图5 人工酶催化在全细胞生物合成中的应用示范
作者进一步通过实验证明该不对称曼尼希反应是否在细胞内发生的。通过设计实验，验证仅含有目的蛋白的菌沉淀具备明显的催化活性，反应中游离辅因子以及可能游离的蛋白对反应影响较小。这些实验表明该不对称曼尼希反应是由细胞内的人工酶而非细胞外的人工酶催化的。作者通过向全细胞体系中额外加入辅因子当量比的谷胱甘肽，观察到反应立体选择性与活性下降非常有限，证明全细胞体系中细胞内谷胱甘肽对催化性能的影响微乎其微，反应12小时后人工酶仍然保持完整二硫键结构，表明胞内组装的人工酶具有良好的稳定性。
图6 人工酶细胞内反应验证实验
为了理解这些人工曼尼希酶在调控立体选择性方面的机制和关键因素，作者进行分子动力学（MD）模拟和QM/MM计算。由于两个底物之间的C-C偶联可能导致产物出现四种立体选择性（R–R、S–R、S–S、R–S），因此在分子对接和分子动力学模拟过程中考虑了四种底物结合构象。在此体系中，仅有R–S相关结合构象的两种底物能够维持稳定且保持适宜的C1-C2距离（3 Å）。后续作者基于分子动力学模拟中确定的稳定结构，进行了QM/MM计算以评估C1–C2键形成的能垒。反应物复合物 (RC) 的 QM/MM 优化结构显示C1-C2距离为2.96 Å。以RC为起点，QM/MM 计算表明C1-C2键的形成面临 5.2 kcal/mol 的能量势垒。值得注意的是，Arg10和Arg56通过形成氢键网络中的盐桥相互作用来稳定底物，这与突变实验结果一致。将这两个残基均替换为丙氨酸会导致产物收率显著降低。随后进一步的分子动力学模拟表明，水分子会进入活性位点并促进水解反应。QM/MM 计算显示，IM1 的水解涉及 20.4 kcal mol⁻¹ 的活化能垒（IM1’→TS3），这表明水解反应可能是整个转化过程中的速率决定步骤。
图7 酶催化曼尼希反应机制解析
总结
本文报道了一种简单、高效的人工酶细胞内构建策略，只需将非天然辅因子与细胞进行短时间混合，即可在细胞内成功构建含非天然催化中心的目标人工酶元件。该细胞内人工酶在非天然不对称曼尼希反应中表现出显著的催化活性，展现出优异的对映体选择性和广泛的底物适用范围。这种在细胞内构建人工酶的策略，在克级规模合成非天然手性分子方面展现出巨大的应用潜力。晶体学分析与计算研究共同为理解人工酶催化反应的立体选择性和催化活性提供了结构基础和机理见解。总体而言，这项工作提出了一种多功能且可推广的方法，用于在细胞内构建具有新功能的人工酶，该策略可广泛应用于扩展人工酶的细胞内催化能力，以实现多种非天然手性化合物的细胞内生产，从而为在活细胞中构建新型非天然生物合成途径提供了一条有效的策略。
这一成果近期发表在Nature Communications上，江南大学周志教授和厦门大学王斌举教授为论文共同通讯作者，江南大学博士生朱致熹、硕士生胡沁汝和厦门大学博士后吴瑶为论文共同第一作者。工作得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金等项目的支持。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-75059-9?sessionid=-info
周志教授课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/zhouzhi
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