Cell Rep | 马军团队揭示猴痘病毒DNA复制关键元件I3L的双环组装和DNA结合机制|dna|单链|复合物|病毒|结构域|马军

近日，深圳湾实验室传染病研究所马军课题组在Cell Reports发表题为Double-ring assembly of mpox virus I3L reveals an unconventional mechanism for ssDNA engagement的研究论文。该研究利用冷冻电镜（Cryo-EM）单颗粒分析技术，解析了猴痘病毒（MPXV）DNA复制关键组分——单链DNA结合蛋白（single-strand DNA binding protein, SSB）I3L的冷冻电镜结构。结构信息结合生化实验，研究揭示了I3L的OB-fold变体单体构架、独特的双环组装模式、新颖的ssDNA结合模式以及长度依赖性的DNA结合机制，为靶向抗猴痘病毒的药物理性设计提供了重要结构基础。

猴痘病毒（Mpox virus, MPXV）是一种正痘病毒属的双链DNA病毒，具有高度传染性，可导致人类出现严重皮肤病变、发热及淋巴结肿大等临床症状。近年来，猴痘疫情在全球多国快速蔓延，世界卫生组织曾两次宣布其构成“国际关注的突发公共卫生事件”（PHEIC），全球累计确诊病例已超15万例，对国际公共卫生安全带来了极大的常态化防控挑战。目前，临床上仍极度缺乏针对猴痘病毒的高效特异性疫苗或获批的临床特效抗病毒药物。痘病毒的DNA复制在细胞中质特化形成的“病毒工厂”内独立进行，高度依赖于病毒自身编码的五种核心复制蛋白构建的精密复制机器。在痘苗病毒中，DNA复制主要由异三聚体DNA聚合酶全酶（E9L-A20R-D4R）、引物酶-解旋酶（D5R）以及单链DNA结合蛋白I3L执行；在猴痘病毒中，对应蛋白分别为F8L-A22R-E4R、E5R和I3L。其中，单链DNA结合蛋白I3L不仅能保护暴露的单链DNA免受核酸酶降解，还作为病毒复制和重组机器的中心枢纽，与多种病毒和宿主蛋白相互作用，发挥关键作用。近年来，痘病毒其他几种核心复制蛋白的结构均已被相继解析。然而，尽管I3L对病毒复制至关重要，但其高分辨率结构信息此前仍处于空白，导致I3L发挥功能的分子机制尚不清楚，这也在一定程度上限制了对痘病毒基因组复制与调控机制的全面理解。

核心研究亮点

1. 揭示独特的双环组装结构

单链DNA结合蛋白（SSB）在几乎所有生物的DNA代谢、复制与保护中都发挥着必不可少的作用。目前已知结构的单蛋白型SSB中，经典的细菌和线粒体SSB以四聚体的形式发挥功能，而部分噬菌体和非洲猪瘟的SSB为单体。研究团队通过在大肠杆菌和昆虫细胞两种表达系统中优化I3L的表达克隆及截短体设计，并精心优化冷冻电镜样品制备条件，利用cryo-EM成功解析了猴痘病毒I3L与单链DNA（ssDNA）复合物的高分辨率结构（分辨率达3.6 Å）。令人意外的是，I3L蛋白并非以常规的四聚体形式存在，而是组装成一种此前未见报道的双层环状结构（Double-ring）。每个单层环由6–10个I3L亚基组成，以八亚基为主导，两个环面对面堆叠形成稳定的双环复合物。这一独特的双环组装方式，为SSB蛋白家族增添了全新的结构类型。

2. 阐明I3L蛋白单体独特的OB-fold变体构架

结构分析显示，猴痘病毒I3L单体与经典的OB-fold结构域具有较高相似性，其中与非洲猪瘟病毒CP312R等病毒SSB的结构同源性最高。然而，I3L在保留OB-fold核心结构域的基础上，在外周区域进化出多个特异性结构元件，形成了一种新型OB-fold变体。研究团队将其单体形态形象地比喻为一把“长嘴浇花壶”：经典的OB-fold-like核心构成“壶身”（Core），辅助结构域形成“壶盖”（Lid）和“把手”，C端延伸的β折叠片则形成特殊的“长壶嘴”（P-tail）。基于这一独特构架，I3L采用了一种新颖的“循环尾部插入”（Cyclic tail-insertion）机制，也称为“衔尾蛇”（Ouroboros motif）组装模式：一个单体的P-tail插入相邻单体的OB-fold结构域，循环重复形成闭合的双环结构。与其他SSB相比，I3L既保留了经典的DNA结合特征，又发展出专有结构元件，体现了痘病毒在细胞质环境中对单链结合蛋白进行的精细功能优化和空间适应。

3. I3L 独特的ssDNA结合模式和协同结合效应

结构分析显示，组装成型的I3L双环结构中心形成了一条贯穿的正电荷内部通道。在I3L–ssDNA复合物的 cryo-EM密度图中，观察到除蛋白质外的额外密度，推测为ssDNA，但其密度质量尚不足以构建原子模型。结合AlphaFold 3结构预测、生物膜干涉技术（BLI）和凝胶电泳迁移率阻滞实验（EMSA）等体外生化实验，研究系统阐明了参与ssDNA结合的关键氨基酸残基及其作用。此外，研究发现I3L对ssDNA的结合呈现典型的“长度依赖性协同效应”：单体形式的结合亲和力随DNA长度增加仅温和提升，而双环复合物则表现出显著的协同效应。其机制可能在于较长DNA可同时占据多个结合位点，降低解离速率并促进邻近亚基的募集，形成“拉链式”结合。值得注意的是，单环突变体的亲和力反而更高，这可能与通道暴露相关，进一步凸显了寡聚化状态与 DNA长度在 I3L 功能中的协同作用。综上，I3L通过“空间包裹+协同捕获”的双重机制，将ssDNA牢牢包裹在双环内部的正电荷通道中，在物理上阻断宿主核酸酶的降解，为病毒基因组的高效复制与维持提供核心保护。这一“装配依赖性”的核酸结合模式显著不同于经典细菌SSB（如 EcSSB以四聚体形式在外周缠绕 DNA）或真核CST复合物，代表了一种独特的“空间包裹”结合策略，为理解正痘病毒属的基因组维持与复制机制提供了全新视角。

本研究通过冷冻电镜结构解析，并结合生化与相互作用验证，揭示了猴痘病毒单链DNA结合蛋白I3L通过特异性双环组装实现基因组保护与协同复制的分子机制，补齐了猴痘病毒DNA复制机器结构生物学研究的“最后一块核心拼图”，显著深化了对正痘病毒DNA复制机制的理解，也为抗病毒药物研发提供了新思路。由于人类宿主细胞内的相似单链结合蛋白（如mtSSB和RPA）在结构和组装模式上与I3L存在显著差异，I3L成为了一个极具吸引力且低脱靶风险的抗病毒药物靶点。未来，可通过设计特异性小分子或多肽，靶向破坏I3L的双环组装或阻断其内部DNA结合通道，从而高效抑制病毒复制。

深圳湾实验室特聘研究员马军和安徽农业大学动物医学院副教授王勇为本论文通讯作者；助理研究员杨侃侃、研究助理盖梦蕊、宋金妙及邹俊伟为本文的共同第一作者。冷冻电镜数据采集工作在深圳医学科学院（SMART）结构生物学平台完成。

原文链接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(26)00737-0

制版人：十一

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（*排名不分先后）