2026年7月23日，清华大学生命科学学院王海峰研究员团队在《自然》杂志发表了题为“Efficient and precise programmable DNA knock-in without double-strand breaks”的研究论文，该团队开发了一种名为CRISPR KNIT的新型基因编辑系统，可以在不切割DNA双链的前提下实现千碱基级别外源基因的高效精准敲入。 清华大学生命科学学院王海峰研究员为本文的通讯作者，清华大学生命学院博士后郜艳敏、2021级博士生马宇、2022级博士生于可欣、北京大学-清华大学-北京生命科学研究所联合培养2021级博士生刘印天为本文共同第一作者。
传统基因编辑技术大多依赖DNA双链断裂来完成外源基因的整合，断裂后的修复过程却常常引发插入缺失突变、染色体易位和脱靶效应，这些非预期的编辑产物给临床应用带来了不小的安全隐患。王海峰团队将Cas9切口酶与单体链霉亲和素融合在一起，配合生物素化的DNA供体，成功将供体模板招募到了切口位点的附近区域。在ACTB基因座敲入eGFP-P2A片段的实验中，这种名为KNIT editor 1的编辑策略实现了49.8%的编辑效率，这个数字与Cas9核酸酶方法相当，插入缺失突变率却比后者降低了215倍之多。研究团队通过一系列遗传学实验证实，这个敲入过程依赖于同源重组修复途径，并且需要RAD51和BRCA2这些关键蛋白的参与。在多个细胞系和不同基因组位点上，KE1都展现出了稳定的编辑效率和极低的非预期突变水平，重复编辑实验的结果也进一步支持了该策略的可靠性。
为了继续提升编辑效率，研究团队借助SunTag系统构建了增强版的KNIT editor 2，让单个切口酶能够通过多价方式招募更多的DNA供体分子。在AAVS1安全港位点，KE2把报告基因的插入效率从55.8%提高到了81.6%，K562细胞中的实验结果同样令人满意，针对ACTB和RAB11A位点的敲入效率分别达到了82.8%和81.5%。这套技术还支持10kb以上大片段DNA的整合，并且在同时编辑多个基因位点的场景下将染色体易位风险控制在了极低的水平。在人类原代T淋巴细胞中，KNIT编辑实现了高效的外源基因敲入，细胞活率和增殖能力都明显优于传统的Cas9处理方法，这为后续的细胞治疗应用打下了良好的基础。
在疾病治疗的验证实验中，研究团队利用KNIT技术将IL2RG和LIPA等治疗性基因的表达框成功整合到了AAVS1安全港位点。在模拟溶酶体酸性脂肪酶缺乏症的LIPA基因突变细胞模型中，无论选择AAVS1位点还是LIPA基因的原位进行野生型cDNA的敲入，都能够有效恢复细胞正常的基因表达水平。在CAR-T细胞工程的应用方面，研究团队通过mRNA方式递送KNIT系统，在TRAC基因座实现了最高40.6%的CAR基因整合效率，这个数值已经达到了此前临床试验中使用的Cas9方法的水平。经过KNIT编辑获得的CAR-T细胞在体外杀伤实验和小鼠肿瘤模型中均表现出了良好的抗肿瘤活性，该技术避开了传统病毒载体和DNA双链断裂方法所伴随的基因组安全风险，为个性化细胞治疗的开发提供了一条新的技术路径。
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