DNA 甲基化是调控基因组印记、X 染色体失活、转座子沉默、细胞衰老与肿瘤发生的核心表观修饰，其稳定维持高度依赖 UHRF1 介导的组蛋白泛素化信号通路。UHRF1 作为衔接 DNA 甲基化与异染色质标记 H3K9me3 的关键蛋白，结合 H3K9me3 后会催化组蛋白 H3 N 端 K14/18/23 位点单泛素化，进而招募甲基转移酶 DNMT1 完成甲基化模式复制。但天然对称核小体包含两条完全相同的 H3，长期以来无法区分 UHRF1 激活后泛素化发生在同一条修饰 H3（顺式）还是另一条无修饰 H3（反式），该机制瓶颈限制了人们对 DNA 甲基化维持精准调控逻辑的理解。
近日，上海交通大学药学院艾华松课题组在《Journal of the American Chemical Society》发表研究，基于SpyTag-SpyCatcher组蛋白预先配对的不对称核小体化学组装技术，在核小体底物上证实 H3K9me3 仅以顺式模式激活 UHRF1 泛素连接酶活性，为解析 DNA 甲基化保真维持的空间调控机制提供直接实验证据，论文题为Chemical Synthesis of Asymmetric Nucleosomes Reveals Intramolecular Activation of UHRF1 E3 Ligase by H3K9me3。
传统组蛋白短肽底物无法还原核小体天然空间构象，常规核小体组装手段也不能实现两条 H3 修饰状态的定向分离。本研究依托 SpyTag/SpyCatcher 生物正交共价偶联体系搭建精准不对称核小体制备平台：先通过定点化学修饰在单条 H3 引入 H3K9me3，分别融合 SpyTag、SpyCatcher 标签；利用二者自发形成不可逆异肽键的特性，组装 “一条带甲基化、一条无甲基化” 的异源 H3 二聚体，再与 H2A/H2B/H4 组装八聚体、包裹含半甲基化 CpG 的 DNA，经 TEV 蛋白酶无痕切除标签，最终得到三类功能明确的核小体底物：仅支持顺式激活的顺式核小体、仅支持反式激活的反式核小体、无 H3K9me3 的阴性对照核小体，全部产物通过质谱、电泳、免疫印迹完成多重严格表征。
图2.基于组蛋白预先配对的不对称核小体的制备与表征
基于三类标准化不对称核小体开展体外酶活定量实验，结果显示：顺式核小体 H3 泛素化转化率高达 26.8%，显著高于反式核小体（14.9%）与空白对照（13.6%）；反式组与对照组活性无统计学差异，证明单独存在于另一条 H3 的 H3K9me3 几乎无法激活 UHRF1。E2 泛素结合酶 UbcH5b 浓度梯度实验进一步验证该顺式偏好性稳定存在；EMSA 实验排除 “蛋白结合亲和力差异” 干扰，证实催化效率区别来自修饰位点与泛素化底物的空间排布；位点特异性免疫印迹直接证明泛素修饰几乎只产生在携带 H3K9me3 的同一条组蛋白尾部。上述数据完整建立了 H3K9me3 顺式激活 UHRF1 的直接证据链。
图3. UHRF1 E3连接酶活性受顺式H3K9me3激活
为探究顺式激活的分子空间基础，研究团队进一步采用CAET（2-((2-氯乙基)氨基)乙硫醇）介导的共价偶联化学与gp41-1分裂内含肽剪接技术，合成了稳定的UHRF1/UbcH5b–Ub/H3K9me3核小体三元复合物模拟物，以捕获瞬时的催化中间体。选择体内主要的泛素化位点H3K23为锚点，通过CAET化学将IntC–UbcH5b–Ub模块定点连接至H3K9me3修饰的H3上，构建顺式探针；同时将gp41-1内含肽N端片段（IntN）融合于UHRF1 C端，通过自发剪接实现UHRF1与UbcH5b的共价连接，从而固定催化模块与底物尾部的相对位置（图4）。
图4.化学合成不对称顺式激活的E2~Ub核小体化学探针
随后，研究利用BS³交联剂对该复合物进行交联质谱（XL-MS）分析，共鉴定到101组独特的赖氨酸–赖氨酸交联肽段，涵盖UHRF1结构域内部、组蛋白内部、UHRF1–组蛋白以及UbcH5b/泛素相关交联信号。基于交联距离约束（Cα–Cα < 30 Å）并整合已有结构信息进行约束性对接，获得顺式复合物的空间参考模型。该模型显示：TTD–PHD模块邻近H3K9me3修饰的H3尾部；SRA结构域呈结合半甲基化DNA的经典构象；UBL结构域与UbcH5b、RING结构域与H3泛素化赖氨酸（K23）均存在近距离交联，支持催化模块与同一H3尾部的空间匹配。
图5.UHRF1/UbcH5b–Ub/H3K9me3核小体复合物的交联质谱分析与结构模型
该工作融合化学蛋白合成、不对称核小体制备、催化中间体捕获、交联质谱结构解析等多学科研究手段，借助生理状态的核小体底物，逐步解析 DNA 甲基化维持通路的空间调控逻辑。研究对表观遗传领域顺/反式激活这一核心科学问题给出了清晰阐释，也印证了定制化不对称核小体探针这一化学生物学工具，可高效解析染色质蛋白的调控模式，为后续探索衰老、肿瘤相关 DNA 甲基化紊乱通路提供了新思路与理论依据。
论文信息：
Chemical Synthesis of Asymmetric Nucleosomes Reveals Intramolecular Activation of UHRF1 E3 Ligase by H3K9me3. Ziyu Xu, Zebin Tong, Tianyi Zhang, Liying Zhang, Yun Liu, Jia-Bin Li, Huasong Ai*.J. Am. Chem. Soc., 2026, doi.org/10.1021/jacs.6c10014.
原文链接：https://pubs.acs.org/jacsat/article/doi/10.1021/jacs.6c10014
艾华松课题组：https://www.x-mol.com/groups/ai_huasong
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