下腰痛是全球范围内导致残疾的首要原因，而椎间盘退变（IVDD）是其主要病理基础之一。椎间盘作为高度特化的纤维软骨组织，其力学功能高度依赖细胞外基质的完整性，尤其是髓核中富含蛋白聚糖的基质和胶原纤维构成的纤维环。在退变进程中，基质稳态被打破，蛋白聚糖流失、胶原纤维降解，导致椎间盘含水量下降、力学稳定性减弱及承重能力受损。这些病理改变的背后，是髓核细胞所处的恶劣微环境——缺氧、营养匮乏、机械过载以及持续存在的氧化应激。更关键的是，铁死亡——一种由脂质过氧化驱动的铁依赖性细胞死亡方式——被证实在髓核细胞功能障碍和IVDD进展中扮演核心角色。过量活性氧、铁过载和抗氧化防御系统受损共同促使脂质过氧化物堆积，诱导髓核细胞发生铁死亡损伤。与此同时，氧化应激与铁死亡与基质分解代谢密切相关，尤其是基质金属蛋白酶13（MMP13）在退变椎间盘中的显著上调，加速了II型胶原和聚集蛋白聚糖的降解。当前临床治疗手段多以缓解症状为主，难以逆转退变进程。基于骨髓间充质干细胞外泌体的无细胞疗法虽展现出调控髓核细胞命运、抑制氧化应激和促进基质合成的潜力，但游离外泌体存在体内清除快、局部滞留差、生物活性难以持续等问题，亟需一种能够根据病理状态按需释放外泌体的局部递送系统。
针对上述挑战，温州医科大学附属第二医院王向阳教授、国科温州研究院周云龙研究员和周晓林博士合作团队，设计了一种MMP13响应性自组装肽水凝胶——Exo@GSH-PTGIKV-(RADA)4（简称Exo@GMRH），用于IVDD治疗中的时空可控外泌体递送与氧化还原调控。该平台集成了三大设计要素：引入MMP13可裂解序列PTGIKV以实现病理响应性水凝胶降解与外泌体释放；嵌入谷胱甘肽作为抗氧化组分以调节氧化还原平衡并抑制铁死亡；以RADA为基础的自组装骨架构建可注射纳米纤维水凝胶网络，实现外泌体的局部滞留。研究假设Exo@GMRH能响应退变椎间盘内升高的MMP13活性，按需释放外泌体和抗氧化肽，抑制铁死亡、恢复基质代谢，最终延缓IVDD进展。该研究为椎间盘再生提供了一种整合疾病响应性递送、氧化还原调控和外泌体介导再生信号的病理适应性生物材料策略。相关论文以“Pathology-Responsive Self-Assembling Hydrogel Enabling Spatiotemporally Controlled Exosome Release and Redox Regulation for Intervertebral Disc Regeneration”为题，发表在Advanced Materials上。
示意图1 可注射自组装Exo@GMRH平台的开发，集成了可编程功能氨基酸侧链与外泌体，通过重塑天然ECM微环境并促进ECM再生，实现无细胞IVDD修复。
MMP13上调与铁死亡在椎间盘退变中的同步关联
研究首先在人体和动物模型中证实了MMP13与铁死亡在IVDD进展中的同步上调（图1）。通过对不同Pfirrmann分级的人腰椎间盘髓核组织进行组织学染色和免疫组化分析，发现随着退变从II级进展至V级，髓核组织基质染色逐渐减弱、纤维化加重、细胞聚集增多，同时MMP13表达显著增强（图1a, b）。蛋白免疫印迹分析进一步显示，严重退变椎间盘中ADAMTS5和MMP13等分解酶表达明显升高，而II型胶原和聚集蛋白聚糖等结构蛋白同步下降（图1c, d）。在铁死亡相关指标方面，促铁死亡酶ACSL4在轻度退变组织中几乎检测不到，但在严重退变组织中显著上调，而铁死亡抑制因子GPX4和SLC7A11则呈进行性下降（图1c, d）。在大鼠尾椎穿刺模型中，上述趋势得到验证——随着退变程度加重，ACSL4和MMP13表达逐步升高，II型胶原表达降低，GPX4免疫组化染色显著减少而MMP13则相反（图1e-j）。通过比较不同细胞死亡抑制剂（凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、Caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1）的治疗效果，发现Ferrostatin-1不仅有效抑制细胞铁死亡进程，还显著下调MMP13表达并保护II型胶原；该结果同时表明，凋亡与铁死亡均参与IVDD退变过程，而铁死亡可能是损伤后退变的主要驱动因素（图1k, l）。体外实验中，随着TBHP浓度递增，髓核细胞中ACSL4和MMP13呈浓度依赖性上升，GPX4则逐渐下降，表明氧化应激可同时促进铁死亡相关损伤和MMP13上调，为以MMP13作为疾病相关酶学信号实现Exo@GMRH响应性释放提供了依据。
图1 MMP13与铁死亡标志物在椎间盘退变进展中的同步上调。（a）不同Pfirrmann分级人腰椎间盘的代表性MRI图像。（b）不同退变分级人髓核组织的H&E染色、番红O染色及MMP13免疫组化染色。（c）蛋白免疫印迹检测不同退变分级人髓核组织中ACSL4、GPX4、SLC7A11、ADAMTS5、MMP13、Collagen II和Aggrecan的表达。（d）蛋白免疫印迹结果的灰度定量分析。（e）不同程度大鼠尾椎穿刺损伤模型的代表性MRI图像。（f）蛋白免疫印迹检测不同程度大鼠髓核组织中ACSL4、GPX4、MMP13和Collagen II的表达。（g）蛋白免疫印迹结果的灰度定量分析。（h）不同程度大鼠髓核组织中GPX4和MMP13的免疫组化染色。（i、j）GPX4和MMP13免疫组化染色的半定量分析。（k）不同细胞死亡抑制剂处理后大鼠尾椎退变模型的代表性MRI图像。（l）蛋白免疫印迹检测不同抑制剂处理后髓核组织中GPX4、ACSL4、MMP13和Collagen II的表达。数据以均值±SD表示，统计学比较采用单因素ANOVA后接Tukey事后检验，p<0.05为具有统计学显著性。
水凝胶的构建与表征：兼具可注射性、MMP13响应降解与广谱抗氧化能力
在材料构建方面，研究团队通过固相合成将MMP13敏感序列PTGIKV和功能性短肽GSH连接至自组装序列(RADA)4的C端，获得功能性自组装肽GMR（图2a）。傅里叶变换红外光谱证实功能基团通过酰胺键共价连接至自组装骨架（图2b）；圆二色谱和透射电镜显示GMR与RADA均形成典型的β-折叠结构纳米纤维，呈现长而均匀、致密交织的特征（图2c；图S2）。将功能化GMR肽与RADA肽溶液以1:1混合并经生理盐水触发物理交联后，可获得浓度为2.0% w/v的GMRH水凝胶（图2d）。流变学测试表明，GMRH的储能模量显著高于损耗模量，频率扫描显示其形成比纯RADA更稳健稳定的三维凝胶网络（图2f）；应变扫描显示GMRH的断裂应变为58.29%，优于RADA的17.68%，展现出更优越的变形能力和抗网络破坏性（图2g）；高低应变循环测试证实其优异的剪切稀化行为，可通过注射器轻松塑形（图2h, i）。扫描电镜确认GMRH三维网络内存在纳米纤维，为髓核细胞黏附和增殖提供仿生微环境（图2e）。在MMP13存在下，GMRH表现出浓度依赖性降解——在200 ng/mL MMP13中，第5天质量损失超过50%，第14天残余质量仅10.20%（图2j）；而在MMP3或ADAMTS5中，水凝胶基本保持完整，第14天分别保留76.36%和86.27%的质量（图S4），表明GMRH对MMP13具有优先响应性而非被IVDD相关蛋白酶广泛降解。在抗氧化能力方面，未修饰的RADA水凝胶几乎无抗氧化活性，而GMRH则展现出强效的浓度依赖性抗氧化性能。在2% w/v浓度下，GMRH对ABTS+自由基的清除率达80%（图2k, l），对羟基自由基的清除率达74%（图2m, n），对过氧化氢的清除率达65%（图2o, p），这归因于接枝的谷胱甘肽分子中高密度的还原性巯基（图2q）。
图2 自组装水凝胶(RADA)和GSH-PTGIKV-(RADA)(GMRH)的制备与表征。（a）工程化自组装肽的示意图。（b）(RADA)和GMR的傅里叶变换红外光谱。（c）(RADA)和GMR的透射电镜图像（比例尺：200 nm）。（d）GMRH水凝胶凝胶化过程的照片。（e）(RADA)和GMRH的扫描电镜图像（比例尺：50 μm）。（f）(RADA)和GMRH的流变学频率扫描，显示储能模量和损耗模量随频率的变化。（g）(RADA)和GMRH的储能模量和损耗模量随应变变化的曲线。（h）GMRH水凝胶在循环低-高剪切应变（1%-100%）下的阶跃应变测量，每个应变间隔保持75 s。（i）水凝胶可注射性的示意图。（j）GMRH水凝胶在不同浓度MMP13（0 ng/mL（PBS）、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL）中14天内的降解过程。（k）紫外-可见吸收光谱显示GMRH水凝胶在12小时内对ABTS⁺自由基的清除活性。（l）GMRH水凝胶对ABTS⁺的清除能力（n=5/组）。（m）紫外-可见吸收光谱显示GMRH水凝胶对羟基自由基的清除活性。（n）GMRH水凝胶对羟基自由基的清除能力（n=5/组）。（o）紫外-可见吸收光谱显示GMRH水凝胶对过氧化氢的清除活性。（p）GMRH水凝胶对过氧化氢的清除能力（n=5/组）。（q）GMRH水凝胶抗氧化机制的示意图。
外泌体表征与水凝胶的响应性释放及体内滞留
研究从新生大鼠股骨中分离骨髓间充质干细胞，经梯度超速离心获得BMSC来源外泌体（图3）。透射电镜显示外泌体为直径约100 nm的闭合椭圆形囊泡，具有典型脂质双分子层膜（图3a）；蛋白免疫印迹证实外泌体标志物CD63、CD9和TSG101阳性表达而内质网标志物Calnexin几乎不可见（图3b）；纳米颗粒追踪分析显示粒径主要分布在70–120 nm范围内（图3c）。Zeta电位测定显示外泌体电位为-13.40±2.44 mV，GMRH为24.28±1.72 mV（图3d），有利于两者通过静电相互作用复合。激光共聚焦显微镜结合Z-stack三维重建（图S6）显示Dil标记外泌体在水凝胶基质内均匀分散。在Transwell共培养体系中（图3e），不同浓度MMP13处理72 h后，释放的外泌体被下层髓核细胞有效内化，且细胞内化外泌体量随MMP13浓度呈剂量依赖性增加（图3f-h）；GSH释放速率同样与MMP13浓度呈正相关（图S8），证实了Exo@GMRH根据病理微环境进行调控释放的行为。活死染色和CCK-8实验证实水凝胶制剂对髓核细胞、纤维环细胞和软骨终板细胞均具有良好的细胞相容性和提取物安全性（图3i, j）。在体内滞留实验中，DiR标记外泌体经椎间盘内注射后，Exo@GMRH组在局部可检测到持续至少14天的荧光信号（图3k, l），而游离外泌体组荧光信号迅速减弱（图3m），证实水凝胶基质有效作为原位储库实现外泌体持续滞留。冰冻切片荧光观察（图S9）进一步发现，释放的DiR标记外泌体与MMP13富集的微环境呈现强烈的空间共定位。需要指出的是，DiR和Dil为脂溶性染料，标记的是囊泡膜而非外泌体特异性成分，因此体内观察到的荧光信号可能来自完整外泌体、膜碎片或染料转移，成像数据应理解为外泌体相关信号的长期滞留与局部分布证据，而非完整外泌体在整个观察期的直接可视化。
图3 BMSC外泌体的表征及Exo@GMRH的响应性释放与体内滞留。（a）BMSC来源外泌体的透射电镜图像（比例尺：200 nm）。（b）蛋白免疫印迹检测外泌体标志物CD63、CD9、TSG101和内质网标志物Calnexin。（c）纳米颗粒追踪分析检测BMSC外泌体的粒径分布。（d）外泌体和GMRH的Zeta电位。（e）体外响应性释放实验的Transwell共培养系统示意图。（f）不同浓度MMP13处理72小时后，髓核细胞内化Dil标记外泌体的共聚焦图像（红色：外泌体；绿色：F-肌动蛋白；蓝色：细胞核；比例尺：20 μm）。（g）流式细胞术检测不同MMP13浓度下髓核细胞摄入Dil标记外泌体的平均荧光强度。（h）定量分析各组内化外泌体的平均荧光强度（n=3/组）。（i）在不同水凝胶表面培养髓核细胞的活/死染色图像（比例尺：100 μm）。（j）CCK-8检测不同水凝胶提取物培养髓核细胞、纤维环细胞和软骨终板细胞1、3、5、7天后的细胞活力。（k）体内外泌体追踪实验示意图。（l）Exo@GMRH组在椎间盘内注射后不同时间点的活体近红外荧光成像。（m）游离Exo-DiR组在椎间盘内注射后不同时间点的活体近红外荧光成像。数据以均值±SD表示，统计学比较采用单因素ANOVA后接Tukey事后检验，p<0.05为具有统计学显著性。
Exo@GMRH重编程氧化应激与铁稳态阻断髓核细胞铁死亡
为阐明Exo@GMRH的保护机制，研究在TBHP诱导的氧化应激髓核细胞模型中评估其对铁死亡相关指标的调控（图4）。蛋白免疫印迹显示，Exo@GMRH显著抑制TBHP诱导的ACSL4上调，有效恢复GPX4、SLC7A11和铁稳态关键调控因子FTH1的表达（图4a-f），协同作用显著减轻铁死亡相关蛋白谱改变。脂质过氧化检测中，BODIPY 581/591 C11染色显示Exo@GMRH处理组氧化脂质（绿色）显著减少（图4b），丙二醛水平测定也证实脂质过氧化产物含量大幅降低（图4h）。FerroOrange染色显示Exo@GMRH有效降低细胞内Fe²⁺水平（图4g）。谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值测定显示Exo@GMRH显著恢复细胞内氧化还原平衡（图4i）。流式细胞术检测活性氧水平显示Exo@GMRH有效清除胞内ROS（图4j, l）。透射电镜观察线粒体形态发现，TBHP处理组线粒体呈现铁死亡特征性改变——体积缩小、膜密度增高、嵴减少，而Exo@GMRH处理后线粒体形态明显恢复（图4k）。JC-1染色检测线粒体膜电位显示，Exo@GMRH有效恢复TBHP引起的线粒体去极化（图4m, n）。上述结果表明Exo@GMRH通过协调调控脂质代谢、抗氧化防御和铁稳态，从多层面阻断髓核细胞铁死亡进程。
图4 水凝胶处理对髓核细胞氧化应激和铁死亡相关标志物的影响。（a）蛋白免疫印迹检测铁死亡相关蛋白ACSL4、FTH1、GPX4和SLC7A11（n=3/组）。（b）BODIPY 581/591 C11染色评估脂质过氧化（绿色：氧化脂质；红色：脂质；比例尺：10 μm）。（c-f）ACSL4、FTH1、GPX4和SLC7A11蛋白水平的灰度定量。（g）FerroOrange染色检测细胞内Fe²⁺的共聚焦成像（比例尺：100 μm）。（h）通过检测细胞内MDA水平定量脂质过氧化（n=6/组）。（i）通过GSH/GSSG比值评估细胞内氧化还原状态（n=6/组）。（j）不同处理条件下流式细胞术检测细胞内ROS水平。（k）透射电镜图像显示不同处理后髓核细胞线粒体形态（n=3/组）。（l）各组DCFH-DA平均荧光强度（n=3/组）。（m）JC-1染色检测线粒体膜电位，以及（n）红/绿荧光比值的定量分析（n=3/组；比例尺：100 μm）。数据以均值±SD表示，统计学比较采用单因素ANOVA后接Tukey事后检验，p<0.05为具有统计学显著性。
Exo@GMRH促进ECM合成并抑制分解代谢
在ECM代谢评估中，阿尔新蓝和甲苯胺蓝染色显示Exo@GMRH处理后髓核细胞糖胺聚糖含量显著高于其他治疗组（图5a, c, d）。蛋白免疫印迹分析表明Exo@GMRH显著上调聚集蛋白聚糖、II型胶原和SOX9等合成代谢标志物，同时抑制MMP13和MMP3等分解酶表达（图5b, e-i）。免疫荧光染色直观显示Exo@GMRH处理后聚集蛋白聚糖和II型胶原荧光强度显著增强、MMP13荧光信号明显减弱（图5j-m）。这些结果表明Exo@GMRH通过协同促进ECM合成和抑制分解代谢，有效重建髓核细胞的基质代谢稳态。
图5 髓核细胞外基质的体外再生评估。（a）不同处理条件下髓核细胞阿尔新蓝和甲苯胺蓝染色的代表性图像，用于可视化糖胺聚糖含量。（b）蛋白免疫印迹检测髓核细胞中关键ECM合成代谢（Aggrecan、Collagen II、SOX9）和分解代谢（MMP13和MMP3）蛋白。（c）不同处理下髓核细胞阿尔新蓝染色的半定量分析（n=3/组）。（d）不同处理下髓核细胞甲苯胺蓝染色的半定量分析（n=3/组）。（e-i）Aggrecan、Collagen II、SOX9、MMP13和MMP3蛋白免疫印迹结果的灰度定量（n=3/组）。（j）髓核细胞中Aggrecan、Collagen II和MMP13表达和定位的代表性免疫荧光图像（比例尺：100 μm；n=6/组）。（k-m）Aggrecan、Collagen II和MMP13免疫荧光图像的半定量直方图（n=6/组）。数据以均值±SD表示，统计学比较采用单因素ANOVA后接Tukey事后检验，p<0.05为具有统计学显著性。
转录组学揭示PI3K-Akt信号通路的激活
为深入探究分子机制，研究对TBHP组和Exo@GMRH组髓核细胞进行RNA测序分析（图6）。火山图鉴定出大量差异表达基因（图6a），热图显示Exo@GMRH处理显著逆转了TBHP诱导的代谢、分解代谢和铁死亡相关基因表达改变（图6b）。基因集富集分析证实TBHP处理组铁死亡通路显著激活（图6c），而Exo@GMRH处理后该通路被有效抑制。KEGG通路富集分析显示，上调差异基因显著富集于PI3K-Akt信号通路、ECM-受体相互作用等通路（图6d）。基因本体分析进一步涉及ECM-受体相互作用、细胞-基质黏附和铁离子稳态等生物学过程（图6e）。蛋白免疫印迹验证显示，Exo@GMRH处理后p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-MDM2/MDM2比值显著升高（图6g）；而加入PI3K抑制剂LY294002后，这些磷酸化水平的升高被逆转。免疫荧光染色也证实Exo@GMRH处理后SLC7A11表达显著增强（图6h, i）。上述结果证实Exo@GMRH通过激活PI3K-Akt信号通路，发挥抗铁死亡和促ECM再生的双重功能。
图6 Exo@GMRH通过PI3K-Akt信号通路重编程转录组以阻断铁死亡并促进ECM再生。（a）火山图显示Exo@GMRH组与TBHP组髓核细胞中差异表达基因。（b）热图展示参与代谢、分解代谢和铁死亡的差异表达基因的独特转录特征。（c）GSEA分析显示铁死亡通路在TBHP处理组中显著激活。（d）上调差异基因中富集最显著的前20条KEGG通路（P<0.05）。（e）差异表达基因的GO分析，包括ECM-受体相互作用、细胞-基质黏附和铁离子稳态。（f）ECM受体相互作用和PI3K-Akt通路的GSEA富集分析。（g）蛋白免疫印迹分析p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-MDM2/MDM2的表达（n=3/组）。（h）SLC7A11表达的代表性免疫荧光染色图像及（i）相应定量分析（n=3/组；比例尺：100 μm）。数据以均值±SD表示，统计学比较采用单因素ANOVA后接Tukey事后检验，p<0.05为具有统计学显著性。
体内实验验证椎间盘再生疗效
研究在大鼠尾椎穿刺退变模型中评估Exo@GMRH的体内治疗效果（图7）。术后4周和8周，X线和MRI影像学评估显示，IVDD组椎间盘高度和T2加权信号强度进行性下降，而Exo@GMRH治疗组在4周和8周均维持了最佳的椎间盘高度和水化信号（图7b-e），MRI分级和椎间盘高度指数定量分析均显著优于游离外泌体和GMRH单药治疗组。大体形态学观察显示，IVDD组椎间盘空间完全塌陷、髓核纤维化硬化，而Exo@GMRH组保持了结构有序、水化良好的髓核组织（图7f, g）。H&E染色显示IVDD组髓核严重萎缩、纤维组织进行性浸润、纤维环-终板完整性完全破坏，而Exo@GMRH组在整个8周观察期内维持了最完整的椎间盘形态，组织学评分最接近健康对照组（图7f-h）。番红O-固绿染色显示Exo@GMRH处理组蛋白聚糖保存效果最佳，显著优于单药治疗组（图7f, g）。免疫组化分析显示Exo@GMRH组聚集蛋白聚糖和GPX4表达显著升高，而MMP13表达被显著抑制至接近健康对照组水平（图8a-d）。生物安全性评估显示，各治疗组间血常规、肝肾功能指标无显著差异，主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）组织学检查均未见明显形态学改变（图8e），证实Exo@GMRH水凝胶具有良好的体内生物相容性。
图7 使用大鼠IVD模型进行椎间盘再生的体内评估。（a）大鼠尾椎椎间盘穿刺损伤及相应治疗流程的示意图。（b）术后4周大鼠尾椎椎间盘的代表性X线和MRI扫描（比例尺：5 mm）。（c）术后8周大鼠尾椎椎间盘的代表性X线和MRI扫描（比例尺：5 mm）。（d）术后4周和8周基于MRI分级的椎间盘水化评分（n=8/组）。（e）基于术后4周和8周X线图像的椎间盘高度指数定量分析（n=8/组）。（f）术后4周大鼠尾椎椎间盘代表性大体矢状切面、H&E染色和SO&FG染色图像。（g）术后8周大鼠尾椎椎间盘代表性大体矢状切面、H&E染色和SO&FG染色图像。（h）不同治疗组和时间点组织学评分变化的热图（n=6/组）。数据以均值±SD表示，统计学比较采用单因素ANOVA后接Tukey事后检验，p<0.05为具有统计学显著性。
图8 Exo@GMRH恢复ECM稳态、抑制铁死亡相关退变并展现良好的体内生物安全性。（a）术后8周椎间盘切片中Aggrecan、MMP13和GPX4表达的免疫组化分析（比例尺：50 μm）。（b-d）术后8周Aggrecan、MMP13和GPX4免疫组化染色强度的半定量评估（n=3/组）。（e）不同处理后大鼠各器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色（n=6/组；比例尺：100 μm）。数据以均值±SD表示，统计学比较采用单因素ANOVA后接Tukey事后检验，p<0.05为具有统计学显著性。
总结与展望
综上所述，本研究成功开发了一种病理适应性Exo@GMRH水凝胶，用于椎间盘退变中的时空可控外泌体递送。该水凝胶兼具优异的可注射性、生物相容性和MMP13响应性降解特性，能够根据退变微环境中MMP13活性水平按需释放外泌体和抗氧化肽，协同发挥抑制铁死亡、恢复氧化还原平衡和促进ECM再生的多重治疗功能。体内外实验一致证实，Exo@GMRH通过激活PI3K-Akt信号通路，有效阻断髓核细胞铁死亡进程，重建基质代谢稳态，最终实现了退变椎间盘的结构和功能恢复。该时空适应性平台为复杂退行性疾病的多方位再生工程治疗提供了极具前景的策略选择，但其临床转化仍需在大动物模型中验证长期疗效和安全性。
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