【ACS Catal.】宁波大学张璇/山东大学刘文剑和王子宽：零点能主导铁酶AusE的去饱和选择性|刘文剑(量子化学家)|宁波大学|山东大学|张璇(影视演员)|氢原子|王子宽|选择性|零点能

背景介绍

非血红素铁/α-酮戊二酸依赖型酶能够借助高活性的Fe(IV)=O中间体活化惰性C–H键，并催化羟基化、去饱和、卤化和环化等多种反应。其中，羟基回弹通常在动力学和热力学上更具优势，因此，酶如何抑制羟基化并选择性促进C–C键去饱和，一直是非血红素铁酶催化机制研究中的重要问题。AusE是构巢曲霉austinol生物合成途径中的一种Fe/αKG依赖型双加氧酶，能够选择性地将preaustinoid A1转化为含C1=C2双键的preaustinoid A2，而不生成更常见的羟基化产物。近日，宁波大学张璇副研究员联合山东大学刘文剑教授和王子宽研究员在知名期刊ACS Catalysis上发表研究论文（DOI：10.1021/acscatal.6c04658），综合运用分子动力学模拟、QM/MM计算、多参考SDSPT2方法，系统揭示了AusE酶催化选择性去饱和的反应机制。研究表明，反应首先由Fe(IV)=O物种夺取底物C2位氢原子，形成C2自由基和Fe(III)–OH中间体，随后Fe(III)–OH继续夺取相邻C1位氢原子，通过连续两次氢原子转移生成C1=C2双键，而非发生C2位羟基回弹。进一步分析发现，C–H键断裂引起的零点能降低是决定去饱和选择性的主要因素，底物相对于金属铁中心的方位、氢键作用以及蛋白环境中的长程电场则进一步抑制羟基回弹。这项工作阐明了核量子效应在金属酶化学选择性调控中的关键作用，为理解其他Fe/αKG依赖型酶的反应多样性以及开展酶工程和仿生催化剂设计提供了新的理论依据。

前沿科研成果

AusE优先活化底物C2位的C–H键

作者首先考察了底物preaustinoid A1在AusE活性口袋中的结合构象。MD模拟结果表明，底物在活性中心保持稳定，并以有利于C2位氢原子活化的方式靠近Fe(IV)=O物种。与C1位相比，C2位距离活性氧更近，表明AusE在反应开始前已经通过底物定位形成了有利于C2–H键断裂的催化构象。

进一步QM/MM计算结果显示，Fe(IV)=O优先夺取C2位氢原子，其反应能垒明显低于C1位氢转移。C2–H键活化不仅在动力学上更加有利，生成的C2自由基中间体IntH2也比C1自由基中间体IntH1更加稳定。因此，AusE催化反应首先从C2–H键断裂开始。

这种区域选择性来源于多种因素的协同作用。首先，AusE活性中心底物和Fe(IV)=O具有良好的空间方位。其次，C2–H2断裂后形成的C2自由基可与邻近羰基发生强烈的共振离域；同时，C2自由基的p轨道还与相邻C1–H1键的σ*反键轨道发生次级超共轭相互作用，进一步提高C2自由基中间体IntH2的稳定性。此外，IntH2中的Fe(III)–OH与Asp148羧酸根之间形成了氢键，而该相互作用在C1自由基中间体IntH1中并不存在。由此，底物取向、自由基离域和活性位点氢键共同决定了第一次氢原子转移优先发生在C2位。

图1. (a) AusE的晶体结构 (PDB: 5YBL): 左侧为蛋白质整体结构图，右侧为结合底物后的活性中心放大图。(b) 从分子动力学模拟轨迹中选取的代表性快照，用于后续QM/MM计算。（图片来源：ACS Catal.）

图2. (a) AusE晶体结构（粉色）与优化后的五重态反应物复合物 ⁵RC（橙色）的叠合，二者的均方根偏差（RMSD）为0.86 Å。(b) 经QM(UB3LYP-D3/def2-SVP)/MM方法优化得到的五重态、单重态、三重态和七重态反应物复合物结构，图中距离单位均为Å。其中，d(Fe–OSUC)表示铁中心与琥珀酸配体两个氧原子之间距离的平均值。（图片来源：ACS Catal.）

第二次氢原子转移优于羟基回弹

在形成IntH2后，反应面临两条竞争路径：一是Fe(III)–OH继续夺取相邻C1位的氢原子，形成C1=C2双键；二是羟基向C2自由基中心回弹，生成羟基化产物。

计算结果表明，第二次氢原子转移的自由能垒仅为1.7 kcal/mol，而羟基回弹需要克服7.9 kcal/mol的能垒。因此，从IntH2出发，去饱和路径在动力学上明显优于羟基化路径，这与实验中仅检测到去饱和产物preaustinoid A2的结果一致。

活性中心的几何构象进一步解释了这种选择性。在IntH2中，呈现出接近线性的氢转移构型，有利于第二次氢原子转移。相比之下，IntH1受到Asp148氢键的限制，难以调整到适合形成C–O键的构象。

除了动力学优势，去饱和产物在酶活性中心中也具有更低的自由能。这一热力学稳定性部分来源于新形成的C1=C2双键与邻近羰基之间的共轭作用。因此，AusE催化的去饱和反应同时受到动力学和热力学因素的支持。

Scheme 2. AusE催化preaustinoid A1去饱和与羟基化的可能反应机制。（图片来源：ACS Catal.）

图3. AusE催化preaustinoid A1去饱和与羟基化的自由能剖面及关键结构。能量单位为kcal/mol，关键距离单位为Å。（图片来源：ACS Catal.）

零点能是决定去饱和选择性的关键因素

尽管底物取向和氢键作用能够解释AusE为何有利于去饱和，但作者进一步发现，真正决定两条竞争路径能量排序的关键因素是核量子效应，尤其是与C–H键振动相关的零点能。

在不考虑完整蛋白环境和零点能校正时，孤立模型反而预测羟基回弹比第二次氢原子转移更加有利，与实验结果相反。加入零点能和蛋白环境效应后，两条路径的能量顺序发生反转，去饱和过渡态变得更加稳定。完整计算结果显示，去饱和过渡态的自由能比羟基化过渡态低6.2 kcal/mol，从而正确重现实验观察到的化学选择性。

为了揭示零点能差异的来源，作者对两个过渡态的振动模式进行了分析。在去饱和过渡态中，C1–H键正在断裂，其伸缩振动频率由中间体中的高频振动显著降低至712 cm⁻¹，使该过渡态的零点能大幅下降。相比之下，在羟基回弹过渡态中，C1–H键并未断裂，仍保持3124 cm⁻¹的高频伸缩振动，因此具有更高的零点能。

仅这一C–H伸缩振动的差异就贡献了约3.4 kcal/mol，与两个过渡态3.3 kcal/mol的总零点能差基本一致。这表明，C1–H键断裂所引起的高频振动降低，几乎完全解释了零点能对去饱和路径的稳定作用。

作者还评估了氢原子隧穿效应，发现两条路径的隧穿校正均较小，不会改变反应选择性。因此，在AusE体系中，主导化学选择性的核量子效应是零点能，而不是量子隧穿。

值得注意的是，SDSPT2计算表明，仅考虑零点能或蛋白环境中的任一因素，都不足以完全重现正确的反应选择性，只有同时考虑二者才能得到与实验一致的结果。相比之下，常规DFT计算可能由于误差抵消，即使不加入零点能也得到表面上正确的能量排序，从而掩盖零点能的真实作用。这一结果说明，计算得到正确的产物选择性并不意味着准确揭示了其物理化学来源。

图5. 去饱和过渡态（TS2H1）和羟基化过渡态（TS2rebC2）相对于反应物复合物（RC）的相对能量（kcal/mol）：（a）在UB3LYP-D3/BS2水平下计算的原始QM区域；（b）在SDSPT2/BS1水平下计算的截断QM模型。（图片来源：ACS Catal.）

图6. 去饱和和羟基化反应关键结构中的简正振动模式与虚频模式。（图片来源：ACS Catal.）

蛋白环境通过长程电场强化去饱和选择性

在明确零点能的主导作用后，作者进一步分析了蛋白环境对反应选择性的调控机制。残基能量分解结果显示，活性口袋周围不同残基对两条反应路径具有不同的稳定作用。其中，Arg88等残基更有利于稳定去饱和过渡态，而另一些残基则产生相反贡献。综合所有残基的作用，完整蛋白环境使去饱和过渡态相对于羟基回弹过渡态进一步稳定约1.3 kcal/mol。

值得关注的是，部分具有显著贡献的残基距离活性中心较远，说明AusE并非仅依赖局部氢键或空间位阻调节反应，而是能够通过整个蛋白环境产生的长程静电场控制化学选择性。作者将酶内禀电场投影到Fe–O键轴方向，并在孤立QM模型中施加相应的定向外电场。结果显示，外电场虽然同时提高去饱和和羟基回弹的能垒，但对羟基回弹的抑制更强，从而使原本偏向羟基化的能量排序发生反转。由此可见，蛋白环境通过对两条竞争路径进行差异化静电调控，进一步强化了AusE的去饱和选择性。

图7. 蛋白环境对去饱和/羟基化反应选择性的调控。（图片来源：ACS Catal.）

基于上述结果，作者提出了AusE催化preaustinoid A1去饱和的完整反应机制。首先，五重态Fe(IV)=O选择性夺取底物C2位氢原子，形成Fe(III)–OH和C2自由基中间体IntH2。随后，Fe(III)–OH继续夺取相邻C1位氢原子，最终形成C1=C2双键并生成preaustinoid A2。

因此，AusE催化的C–C去饱和遵循连续两次氢原子转移机制，而不是经过碳正离子中间体的单电子转移—脱质子机制。底物取向和氢键作用为反应提供有利的局部构象，蛋白内禀电场进一步抑制羟基回弹，而C–H键断裂产生的零点能降低最终决定了去饱和路径的能量优势。这项工作不仅深化了对AusE催化机制的认识，也为理解其他Fe/αKG依赖型酶中羟基化、去饱和及其他自由基反应的化学选择性提供了新的理论视角，并为相关酶工程和仿生催化剂设计提供了参考。

Scheme 4. AusE催化preaustinoid A1选择性去饱和的反应循环。（图片来源：ACS Catal.）

这一成果近期发表在ACS Catalysis上，宁波大学张璇副研究员和山东大学刘文剑教授、王子宽研究员为论文共同通讯作者，山东大学博士生赵圆圆为论文第一作者。工作得到了国家自然科学基金等项目的支持。

课题组简介

青岛理论与计算科学研究院（QiTCS）成立于2018年底，创院院长为国际量子分子科学院院士、英国皇家化学会会士、教育部“长江学者”刘文剑教授。

研究院面向理论与计算科学前沿，致力于发展化学、物理、材料科学、生物物理及应用数学领域的新理论、新方法、新算法和自主科学软件，并推动相关方法在复杂分子、功能材料、凝聚态体系及生物体系中的应用。

近五年来，研究院承担和完成了多项国家级科研课题和科技开发项目，在Chem. Rev.、Acc. Chem. Res.、Nat. Commun.、J. Am. Chem. Soc.等国际学术期刊发表高水平论文百余篇；开发了具有完全自主知识产权、特色鲜明的量子化学计算软件包BDF（Beijing Density Functional），并已实现商业化应用，为复杂分子体系的电子结构、激发态性质及相关化学过程研究提供了重要计算平台。

QiTCS目前依托山东大学激光与红外系统教育部重点实验室（https://lit.qd.sdu.edu.cn/index.htm）招收硕士、博士研究生，待遇丰厚，有意者可联系刘文剑教授（liuwj@sdu.edu.cn）。QiTCS主页：https://www.qitcs.qd.sdu.edu.cn/index.htm。

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教授简介

通讯作者：刘文剑，山东大学讲席教授、博士生导师，青岛理论与计算科学研究院创院院长，教育部“长江学者”特聘教授、国家杰出青年科学基金获得者、国际量子分子科学院院士。长期从事量子电动力学与相对论量子化学、强关联多体理论、含时密度泛函理论及相对论核磁性质理论研究。建立了eQED、Q4C、X2C等相对论量子力学方程，发展了SDSPT2、SDSCI、iCI、iCIPT2等强关联电子结构方法，并系统推进相对论、自旋适配、非绝热耦合及线性标度含时密度泛函理论的发展。主持研发了具有完全自主知识产权的量子化学计算软件包BDF。曾获国际量子分子科学院奖、亚太理论与计算化学家协会Pople奖和Fukui奖、德国洪堡基金会Bessel研究奖等多项学术奖励。

通讯作者：王子宽，山东大学青岛理论与计算科学研究院研究员。先后在北京大学获得学士和博士学位，并在北京大学及德国马克斯·普朗克煤炭研究所从事博士后研究。主要从事理论与计算光化学研究，重点关注激发态电子结构方法的发展与应用。围绕大体系电子结构和激发态动力学计算，发展了半经验量子化学方法NOTCH、自洽场求解与收敛加速算法SMH、自旋和空间对称性匹配的TDDFT解析梯度方法及非绝热耦合矩阵元，以及数值Hessian算法O1NumHess。在 Acc. Chem. Res.、Nat. Commun.、J. Am. Chem. Soc.、J. Chem. Theory Comput.、J. Chem. Phys.等期刊发表论文近50篇，任Int. J. Quantum Chem.青年编委。

通讯作者：张璇，宁波大学新药技术研究院副研究员，2015年获山东大学化学生物学学士学位，2020年获北京大学理论计算化学博士学位，随后在厦门大学从事计算生物学博士后研究。主要从事酶催化反应的多尺度理论模拟研究，综合运用分子动力学（MD）、量子力学/分子力学（QM/MM）及QM/MM分子动力学等方法，解析金属酶催化反应机理、电子转移过程以及蛋白-蛋白和蛋白-小分子相互作用。研究重点包括P450酶和依赖α-酮戊二酸（α-KG）酶的理性改造、酶促C-H键活化及选择性羟基化反应调控等。以第一、通讯（共同）作者身份发表文章于Nat. Synth、J. Am. Chem. Soc.（3）、Nat. Commun.（3）、ACS Catal.（8）和Chin. J. Catal.(2) 等期刊。目前主持国家自然科学青年基金、厦大国重实验室开放基金等。