《蜘蛛侠4》的真正反派，其实并不是毒蝎、狼蛛、回旋镖、手合会这些人，这些只是出现在电影前30分钟的敌人。
彼得将面对的真正反派，是来自《蜘蛛侠3》结尾的彩蛋，当时毒液和宿主埃迪已经来到“MCU宇宙”，也就是616主宇宙，这个宇宙里发生了灭霸清除一半人口的事件，也就是说毒液在人口消失的五年期间来到了主宇宙，他当时虽然没有停留就又走了，可是他却留下一个碎块，这个碎块成为电影最大的悬疑，说明这个碎块必然被坏人利用，产生了毒液的新变异体。
其次，在《毒液2》结尾时也有一个彩蛋，其中就是毒液通过时空共振而穿越到漫威宇宙的事件，当时毒液看到了电视里的蜘蛛侠，还说了也一句“那家伙”，说明毒液已经对彼得帕克产生敌意。
除此之外，惩罚者和浩克也会客串到这部电影，其中浩克是以绿巨人的身份出现，他当时双手合十，猛击掌心，制造出一股冲击波，震碎了好多玻璃。浩克还说了一句“没有班纳，只有野蛮浩克”，说明野蛮状态的浩克也回归到了蜘蛛侠的世界。
其次，惩罚者开着一辆硬核越野车，并对蜘蛛侠开了一枪。让彼得十分懊恼。本次还有一个戴着头套的神秘反派，她是由演员萨迪·辛克饰演，也是反派阵营的一部分，将会成为彼得帕克的劲敌。
如今彼得帕克已经遭受奇异博士的遗忘咒，被所有人忘记他的身份，包括复联成员也不再认识他，尤其是女友MJ也不认识他，并且MJ甚至已经有了新男友。
彼得帕克在遭受情感创伤之后，他体内的蜘蛛DNA活性大幅度飙升，并诱发了突变，感官机能全部进阶，让他能捕捉到快速运动的回旋镖，甚至双手的蛛丝也能全方位自由释放，可以对敌人进行群体攻击，也可以让身体灵活地穿梭于高空。
彼得帕克已经不再是一个学生，在遭受梅姨死亡，女友遗忘，朋友散失。他已经变得有些黑暗、有些成熟。在找到班纳博士之后，他的身体度过了变异虚弱期，同时一群强敌找上他，他一个人要对付的敌人很多，就蝎子、狼蛛和回旋镖这些人，都够他吃一壶了，再加上手合会的围剿，他已经孤掌难鸣，根本应付不过来，如果不是浩克和惩罚者这些硬派英雄辅助他，他基本上没有机会战胜这些人。其次他还得对付神秘头套人，以及隐藏在幕后的毒液变异体。
电影有一个细节，一名黑人对彼得说：“我们正面对一个无法掌控的危机，甚至看不见的危险”。然后镜头切入神秘头套人，说明这个敌人很可能是头套人，并且这个人会释放一种冲击波，这种冲击波会一直扩散到城市区域，波及到普通人。只有彼得是唯一能免疫这种伤害的人，彼得也是唯一能感知它的人。
其次电影还出现了一种金色射线，这种射线会在人体上反射，形成一种标注数值的折线。这些也是神秘人制造出的东西。彼得身负使命，只能一个人独自解决这些问题。
作为彼得的朋友奈德，他如今已经不认识彼得，还收集了无数线索，制作出了一个线索板，并一直在调查蜘蛛侠的真实身份，甚至他已经接近真相。在彼得闯入他和MJ的家中时，彼得发现了线索板，同时被奈德撞上了，奈德十分惊讶MJ不认识彼得，说明奈德已经知道彼得的真正身份，甚至知道他们之前的关系。
电影还有一幕，彼得双眼变得发红，他在街头时，有个黑人问他“你还好吗？我们可以帮你摆脱体内的怪物”。说明彼得身上出现了一些问题，并且他自己没发解决，才有了这些对话。
总之，本片是蜘蛛侠面对敌人最多，问题最棘手的一部作品，而且电影有很多让人惊喜的地方，比如野蛮浩克的出现，真的是蜘蛛侠宇宙的新开端。
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