个性化肿瘤疫苗是将肿瘤突变中独一无二的neoantigen（新抗原）作为免疫系统靶点的一种策略。相比其他载体，利用mRNA编码个性化肿瘤抗原具有平台性、可快速定制等显著优势。那么，mRNA技术的平台性优势具体体现在哪些方面？如何快速设计一款mRNA个性化癌症疫苗？
2017 年，BioNTech联合创始人Ugur Sahin和Özlem Türeci团队在Nature杂志上发表的里程碑论文《Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer》，证明了利用个性化mRNA疫苗靶向患者‘mutanome’（突变组）的可行性。该研究还公开新抗原的发现、筛选、以及多表位mRNA疫苗的设计思路。
新抗原的发现与验证
1.深度测序（NGS）
- 全外显子组测序（WES）：对肿瘤组织和匹配的PBMC（外周血单个核细胞，作为生殖细胞系对照）进行测序，DNA文库reads深度需达到足够覆盖度，以捕捉低频突变。
- 转录组测序（RNA-seq）：仅考虑在RNA水平实际表达的突变，因为只有被转录的突变才可能翻译成蛋白并呈递给T细胞。需确认突变碱基在RNA-seq中的表达频率。
2.生物信息学筛选逻辑
- 基础过滤：仅保留非同义单核苷酸变异（SNVs），剔除无义突变，且要求该突变在RNA-seq中有明确表达。
- 双原则优先排序（Prioritization）
- 原则1：预测与患者自体HLA II类分子具有高亲和力，且RNA表达量高。
- 原则2：预测与HLA I类分子具有高结合亲和力。
- HLA结合预测算法：采用IEDB推荐的T细胞表位预测工具。其中HLA I类（HLA-A/B）评估包含突变位点的8–11mer肽段；HLA II类（HLA-DRB/DQB）评估15mer肽段。计算多个预测工具的“共识分数（Consensus Score）”，以每个变体的最佳（最低）分数作为最终排名依据。
- 差异化参数：当多个候选抗原排名接近时，优先考虑肿瘤中变异等位基因频率（VAF）较高的突变。
- 人工决策：综合MHC I/II类结合预测分数、基因表达量（RPKM）和VAF等多维度指标，每位患者最终选定10个（少数为5个）排名靠前的突变位点。
3.金标准验证
对筛选出的候选位点进行Sanger测序验证，排除测序误差，确保疫苗序列的绝对准确性。
mRNA多表位疫苗序列设计
文献采用了五表位mRNA疫苗骨架，抗原区域设计原则如下：
信号肽序列(Signal Peptide, SP)：位于序列的N 端，序列为 MRVTAPRTLILLLSGALALTETWAGS。其作用是引导翻译出的蛋白质进入内质网，启动抗原加工流程。
核心抗原设计：每个新抗原被设计为一个长度为27 个氨基酸的肽段，选定的体细胞突变（SNV）精确地位于该 27mer 肽段的第 14 位,。这种设计确保了突变位点周围有足够的侧翼序列，以便在细胞内加工后能够产生多种不同的HLA 结合表位。
MHC I类运输域 (MHC class I trafficking domain, MITD)：位于序列的C 端，序列为IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA。MITD 有助于将抗原定向运输到 HLA I 类和 II 类分子的呈递途径中，从而增强 T 细胞的激活效果,。
Linker设计：研究采用了非免疫原性的甘氨酸/丝氨酸 (Glycine/Serine, G/S) 连接子来串联信号肽、5个抗原肽段和MITD段。具体的连接序列如下：起始连接序列 (Start Linker)：用于连接信号肽和第一个抗原。在患者P01-P07 中使用的是LQ，而在其他患者中使用了GGSGGGGSGG。中间连接序列(Middle Linker) GGSGGGGSGG 序列，用于连接5个抗原单元。末端连接序列(End Linker)： 用于连接最后一个抗原和MITD，采用 GGSLGGGGSG 序列。
小结
通过上述新抗原筛选与mRNA序列优化策略，研究团队成功构建了个性化多表位mRNA疫苗。随后，他们通过系统性免疫学实验验证了疫苗的有效性。
1.效应T细胞应答分析（IFN-γ ELISpot）
- 直接检测：观察接种前后PBMC对15mer重叠肽库（OLPs）的即时反应。
- 体外扩增后检测（IVS）：将PBMC与转染患者mRNA的自体树突细胞（DCs）共培养11天，扩大特异性T细胞克隆，提高检测灵敏度。
2.表型与功能刻画（流式细胞术 + Multimer）
- 使用HLA多聚体（Multimer）标记突变特异性CD8+ T细胞，追踪其扩增动力学。
- 评估T细胞记忆表型（CD45RA、CD197）和耗竭标志物（PD-1）表达。
- 通过胞内细胞因子染色（ICS）检测多功能性，确认T细胞能否同时分泌IFN-γ、TNF和IL-2。
3.功能验证：诱导的T细胞能否真正杀伤肿瘤细胞？
- TCR克隆与重编程：从患者样本中分选IFN-γ阳性单细胞，克隆其TCR α/β链，并转染至健康供体T细胞，验证其对患者肿瘤细胞的识别能力。
- 体外杀伤实验（Cytotoxicity Assay）：以自体肿瘤细胞系或转染HLA/B2M的K562细胞为靶细胞，采用荧光素酶释放法或Caspase-3/7活性检测细胞裂解和凋亡。
- 特异性测试：对比T细胞对“突变肽”与“野生型肽”的反应，确认疫苗诱导的免疫应答具有高度特异性，低脱靶风险。
参考文献
[1] Sahin U, et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature, 2017.
[2] Weber JS, et al. Individualised neoantigen therapy mRNA-4157 (V940) plus pembrolizumab versus pembrolizumab monotherapy in resected melanoma (KEYNOTE-942): a randomised, phase 2b study. Lancet. 2024.
注：本文仅作为医疗健康领域前沿进展分享， 非 治 疗 方 案 推 荐。
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来源| RNA星球
校稿| Alice编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Leon
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