碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）被世界卫生组织列为亟需新抗生素的重点病原体，其耐药基因blaKPC常位于接合性质粒上，通过水平转移在菌株间快速扩散。尽管ST15型CRKP菌株携带针对这些耐药质粒的I-E 型CRISPR-Cas免疫系统，耐药质粒依然在该克隆中稳定存在，此前研究团队推测其中可能存在抗CRISPR（Acr）蛋白的主动抑制。2026年8月3日，复旦大学附属华山医院抗生素研究所王明贵团队和复旦大学生命科学学院麻锦彪团队在《Nature Communications》期刊在线发表题为“Dynamic balance of CRISPR-Cas immunity and resistance plasmid anti-immunity mediated by a bifunctional protein AcrIE10”的研究论文。该工作系统揭示了质粒编码的双功能蛋白AcrIE10通过其N端RHH结构域实现转录自抑制、同时通过C端Acr结构域抑制Cas7 亚基，从而在CRISPR免疫压力和质粒抗防御之间建立动态平衡的分子机制。
研究团队首先通过生物信息学分析发现，acrIE10基因在9358株肠杆菌科基因组中的检出率为13.7%，在ST15型CRKP临床分离株中高达94.3%，并且超过97.4%的acrIE10基因定位于质粒上。进一步的质粒稳定性实验显示，acrIE9.2-acrIE10基因座能够显著保护携带靶向原型间隔序列的质粒免受I-E CRISPR-Cas系统的清除。研究团队利用X射线晶体学解析了AcrIE10与其启动子区反向重复序列DNA的复合物结构（分辨率3.6 Å），发现AcrIE10的N端RHH结构域以二聚体形式识别IR序列，每个单体通过β-折叠片上的R7、N8和S10残基与DNA碱基发生特异性相互作用，其中R7A突变完全消除了DNA结合能力。两个AcrIE10二聚体需要进一步形成二聚体-二聚体界面才能稳定结合完整的20 bp IR DNA，IR序列中间的间隔区长度对界面形成至关重要，间隔为2 bp时结合效率最高，缩短至0 bp或延长至4 bp以上均显著削弱DNA结合。
在揭示AcrIE10的Aca功能之后，研究团队进一步探究了其Acr功能与Aca功能之间的相互调控关系。他们利用冷冻电镜单颗粒分析解析了AcrIE10-Cas7-IR DNA三元复合物的结构（分辨率3.4 Å），发现Cas7的结合位点与AcrIE10二聚体-二聚体界面在空间上高度重叠，关键残基E78和D81同时参与Cas7结合和二聚体间相互作用。电泳迁移率变动实验显示，低浓度Cas7与AcrIE10和IR DNA形成协同三元复合物，Cas7浓度继续升高则导致三元复合物解离和游离DNA重新出现，这种双相效应完全依赖于Cas7与AcrIE10的直接结合。研究团队通过尺寸排阻色谱和等温滴定量热法证实，AcrIE10与Cas7以1:1摩尔比形成2:2四聚体复合物，该复合物完全丧失DNA结合能力；当AcrIE10过量时则形成2:1化学计量比的复合物，其DNA结合亲和力与游离AcrIE10二聚体相当。
基于上述结构生物学和生物化学证据，研究团队提出了AcrIE10介导的动态平衡模型。在CRISPR-Cas系统处于静默状态时，AcrIE10以二聚体-二聚体的形式结合在acr启动子区的IR序列上，抑制acrIE9.2-acrIE10操纵子的转录。当质粒入侵激活宿主CRISPR-Cas免疫系统后，游离Cas7亚基浓度升高，Cas7竞争性结合AcrIE10二聚体的外表面，破坏其二聚体-二聚体界面，使AcrIE10从启动子DNA上解离，从而解除转录抑制。去抑制后acr操纵子大量转录表达AcrIE9.2和AcrIE10，其中AcrIE10通过结合Cas7抑制新的Cascade复合物组装，AcrIE9.2则作用于已组装的Cascade复合物，协同阻断CRISPR免疫。AcrIE10大量积累后重新形成2:1化学计量比的AcrIE10-Cas7复合物，该复合物保留DNA结合能力，可重新结合启动子恢复转录抑制，形成负反馈调控回路。该机制揭示了耐药质粒通过编码双功能Acr-Aca蛋白主动感知并响应宿主CRISPR免疫压力的精细调控策略，为理解临床CRKP菌株中blaKPC质粒的稳定维持提供了全新视角。
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