图 1随机分散在玻璃盖玻片上的金纳米棒的多焦双光子图像。信号强度的差异可以通过在 LPSR 处激发杆或杆聚合来解释。
背景
Redmar Vlieg 的研究属于 John van Noort 小组，主要涉及使用双光子显微镜来研究斑马鱼胚胎的生物过程以及金纳米棒 (GNR) 的体外测量。
由于其局域表面等离子体共振 (LSPR)，GNR 具有独特的光学特性，使其可用作单分子传感器或非常明亮的发光标记。共振频率取决于棒近场的折射率，因此可以通过测量该频移来检测小分子的扰动。通过双光子显微镜的非线性激发机制激发 GNR，可以提高灵敏度以检测更小的分子。
除了检测单分子外，GNR 还用作发光标记。当激发光与入射的电磁波耦合时，局域表面等离子体共振会显着增加激发光的吸收，使它们像量子点一样明亮。此外，GNR 还具有不会漂白和闪烁的额外优点，并且其表面可以轻松功能化以用于生物应用。因此，该小组研究了使用 GNR 作为双光子造影剂进行体内测量的优点。
挑战
该小组在使用 GNR 时面临的一个问题是，当棒的温度升高时，即使在相对较低的温度下，棒的末端也会开始扩散。尽管黄金在 3000°C 左右熔化，但尖端在低得多的温度下开始扩散。当金纳米棒开始失去形状时，它们开始失去纵横比，这会导致局域表面等离子体共振发生变化，使它们无法用于成像。
该小组最初使用带有 60 倍 TIRF 油透镜的 EMCCD 相机进行体外研究。然而，油物镜的工作距离非常短，不适合斑马鱼胚胎等厚样品的体内成像。因此，他们改变了设置，采用单个 25 倍物镜，以实现更长的工作距离和更大的视野，这需要更合适的相机来最大限度地提高速度和分辨率。
因此，该小组希望使用尽可能低的激发光进行成像，以防止其 GNR 标记物遭到破坏，并以高速对体内样本进行成像，以实现单分子追踪。因此，该小组对背照式 sCMOS 相机很感兴趣，因为它们具有高 QE 以及大型传感器和快速读出速度。
Prime BSI 具有低读出噪声、高量子效率和大传感器尺寸，满足我们对相机的所有需求。——雷德玛·弗利格
解决方案
van Noort Group 现在在其多焦多光子定制显微镜上使用 Teledyne Photometrics Prime BSI 背照式 sCMOS，放大倍率为 25 倍，并使用 LabVIEW 控制系统的所有组件。 Redmar Vlieg 告诉我们，“Prime BSI 附带的 LabVIEW 驱动程序使我们能够按照我们想要的方式将相机集成到我们的内部构建显微镜中。”
Redmar Vlieg 继续说道：“我们决定使用 Prime BSI，因为与市场上其他背照式相机相比，它的像素尺寸更小，因此最适合高分辨率跟踪。此外，我们的 EMCCD 相机 QuantEM:512SC 也来自 Photometrics，它的性能始终非常出色”。
具有高量子效率可以减少曝光时间，这对于他的应用来说是理想的，允许在不改变金纳米棒结构的情况下对其进行成像。 Redmar Vlieg 还表示，该相机具有很大的优点，例如没有过多的噪音和没有增益衰减。
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