Science｜线粒体双向运输分子开关：TRAK蛋白协同调控驱动蛋白与动力蛋白新机制|分子开关|激酶|磷酸化|线粒体|细胞|蛋白|马达

撰文 | 水王星

细胞内线粒体的空间分布会随细胞应激和局部能量需求动态调整，该过程完全依赖微管轨道上两种极性相反的分子马达蛋白。驱动蛋白（ kinesin ，向细胞外周、微管正极转运，顺向运输）负责将线粒体输送至突触、细胞突起等耗能区域，胞质动力蛋白（ cytoplasmic dynein ，向细胞中心、微管负极转运，逆向运输）介导受损线粒体向中心体聚集完成降解清除。学界早已证实两种马达蛋白可同步结合线粒体衔接蛋白TRAK（ trafficking kinesin-binding protein ，转运驱动蛋白结合蛋白），但 TRAK 如何在两种反向马达间切换活性，细胞应激信号如何调控该切换过程，始终缺乏完整分子机制。

近日，霍华德休斯医学研究所 Janelia 研究中心 Christina Gladkova 与 Ronald D. Vale 团队在 Science 期刊发表题为 A molecular switch for coordinating kinesin and dynein transport of mitochondrial cargo 的研究论文。该工作结合人工合成货物转运体系（ synthetic cargo transport assay ）与AlphaFold2结构预测定点突变技术，鉴定出TRAK蛋白上一段名为动力蛋白调控螺旋（DRH， dynein regulatory helix ）的功能区域，阐明DRH 构象变化是线粒体顺向、逆向运输切换的核心分子开关，并揭示氧化应激通过MAP激酶磷酸化修饰DRH上游位点激活线粒体逆向转运的通路。

为规避线粒体自身裂变融合、肌动蛋白互作带来的实验干扰，研究团队搭建了一套标准化人工合成货物检测体系。该体系以可自组装为 25 纳米笼状结构的 I3-01 蛋白为货物骨架，融合线粒体膜受体 Miro1 胞内段，实现货物与 TRAK 转运机器的特异性结合，同时搭载荧光标签方便定量追踪货物在细胞外周、细胞核周（中心体区域）的分布。

实验结果显示，哺乳动物两类 TRAK 亚型功能存在显著分化， TRAK1 会介导合成货物大量聚集在细胞外周，对应驱动蛋白主导的顺向运输； TRAK2 介导货物双向移动，稳态下以细胞核周富集的动力蛋白逆向运输为主。免疫共沉淀数据证明，两种 TRAK 结合的动力蛋白和动力激活蛋白（ dynactin ）总量相近，但 TRAK1 结合驱动蛋白的丰度是 TRAK2 的 20 倍。

为解析马达切换的结构基础，研究人员利用 AlphaFold2 多聚体模型预测 TRAK 蛋白三维构象，发现 TRAK N 端存在一段可回折的螺旋结构，也就是 DRH 。 DRH 折叠闭合时会占据 TRAK 上动力蛋白轻链（ light intermediate chain ，LIC）的结合位点 CC1-box ，此时动力蛋白无法活化，驱动蛋白稳定结合 TRAK ，线粒体发生顺向运输； DRH 打开后， LIC 可结合 CC1-box ，动力蛋白被激活，同时驱动蛋白从 TRAK 上解离，线粒体转向逆向运输。

团队通过 TRAK1 与 TRAK2 螺旋结构域互换嵌合实验以及疏水残基定点突变两类实验验证该模型。将 TRAK2 的 DRH 替换为 TRAK1 序列后， TRAK2 介导的货物转运显著偏向外周；破坏 DRH 疏水界面的突变会强制螺旋打开，原本只介导顺向运输的 TRAK1 转而驱动货物向细胞核周聚集。同时双突变实验证实，若删除 TRAK 结合 dynactin 的 Spindly 基序， DRH 打开带来的驱动蛋白解离效应会被逆转，证明活化的动力蛋白复合物会直接拮抗驱动蛋白与 TRAK 的结合。

在此基础上，研究团队继续探究细胞生理信号对 DRH 开关的调控方式。质谱修饰分析筛选到 TRAK2 DRH 紧邻的第 84 位丝氨酸（ S84 ）是保守磷酸化位点，该位点不存在于 TRAK1 对应同源区域。研究构建 S84A （阻断磷酸化）、 S84E （磷酸化模拟突变）两种突变体， S84A 突变体结合更多驱动蛋白，逆向转运能力显著下降； S84E 突变体稳定维持 DRH 开放构象，持续激活动力蛋白转运。该位点的氨基酸序列符合应激激活的丝裂原活化蛋白激酶（ Mitogen-Activated Protein Kinase ， MAPK ）家族中 JNK2 与 p38 的保守底物特征，后续激酶敲低实验进一步证实， JNK2 是特异性调控该磷酸化位点的核心激酶。砷化物诱导氧化应激处理细胞后， JNK 通路激活， TRAK2 S84 发生磷酸化，线粒体全部向细胞核周聚集；敲低 JNK2 或使用 S84A 突变体时，氧化应激无法触发线粒体逆向聚集。

最后研究使用纤维连接蛋白图案化细胞，观察天然线粒体的分布规律，人工合成货物得到的全部调控机制均可在真实线粒体上复现。该调控通路还具备保守拓展性，溶酶体衔接蛋白 JIP3 和 JIP4 含有同源自抑制螺旋，螺旋附近丝氨酸磷酸化同样可以激活动力蛋白转运。

本研究完整搭建了线粒体双向转运的分子调控通路，首次定义DRH作为衔接蛋白的通用马达切换开关，打通氧化应激信号、激酶磷酸化和线粒体转运重分布的分子链条。大脑组织高表达 TRAK2 ，而神经细胞极易产生活性氧损伤线粒体，该机制为神经细胞应激状态下受损线粒体回收降解提供直接分子解释，同时为细胞器双向转运相关神经退行性疾病、代谢疾病提供全新靶点思路。