Cell | 全基因组转座子诱变技术揭示巨型噬菌体的生存密码——为理解噬菌体基因功能和宿主互作提供强大平台|噬菌体|宿主|座子|核酸|衣壳|诱变技术|转座

撰文丨易

噬菌体的基因组通常编码密集，其中包含了大量功能未知的基因。尽管这些未表征的基因可能隐藏着许多重要的生物学发现，但目前用于对噬菌体进行无偏的全基因组研究的工具却非常有限，尤其对于基因组超过200kb的大型裂解性噬菌体（如巨型噬菌体）而言，挑战更为突出。对于这类噬菌体，甚至连其复制所必需的基本基因清单都尚不明确。以铜绿假单胞菌的模型巨型噬菌体ΦKZ 为例，它拥有独特的感染生物学特性，包括一个蛋白质构成的噬菌体细胞核以及复杂的RNA聚合酶复合物。然而，哪些基因严格参与这些核心生物学过程，哪些基因虽非必需但在特定宿主或环境中发挥条件性重要作用，目前仍不清楚。现有的靶向噬菌体基因组编辑工具，如同源重组和CRISPR-Cas系统，通量较低；而重组工程等方法虽有效，但尚未普及。为了像细菌转座子插入测序那样简便地对噬菌体进行全基因组修饰，亟需开发一种类似的、适用于噬菌体的全基因组插入诱变方法。

近日，美国加利福尼亚大学Joseph Bondy-Denomy在Cell期刊上发表题为Bacteriophage genome-wide transposon mutagenesis的研究论文，开发了一种名为噬菌体转座子诱变与测序（TnSeq）的高通量技术，通过在巨型噬菌体ΦKZ和碱基修饰噬菌体YuA中构建全基因组插入突变文库，系统鉴定了大量必需基因、适应性相关基因及条件性必需基因，为理解噬菌体基因功能和宿主互作提供了强大平台。

研究团队首先通过将mariner转座酶与能定位到噬菌体 “细胞核” 的Nlp1蛋白融合，成功克服了巨型噬菌体ΦKZ的物理屏障，使转座反应得以在其受保护的基因组区域内高效发生。为筛选数量稀少的转座事件，设计了一个携带抗CRISPR基因（ acrVIA1 ）的转座子供体，并结合同时靶向两个必需基因（主要衣壳蛋白和RNA聚合酶亚基）的双重crRNA阵列与Cas13a核酸酶系统，实现了对野生型噬菌体的极强限制和对成功转座突变体的高效富集。通过多轮独立的转座感染和筛选，构建了一个包含来自十个生物学重复样本的ΦKZ突变体文库。随后，团队对该文库进行噬菌体转座子插入测序（TnSeq），获得了总计超过300万个高质量测序读长，最终在全长280,334bp的基因组上鉴定出6,667个独特的转座子插入位点，平均每42个碱基对就有一个插入，达到了近乎饱和的全基因组覆盖度。基于这个高密度的插入图谱，团队发现约70%的基因（约261个）能够耐受插入而被归类为非必需，而约30%的基因则缺乏有效的破坏性插入，被初步判定为潜在必需基因。

随后，为了验证TnSeq数据的准确性并排除潜在的假阳性，利用Cas13a核酸酶分别靶向预测为必需或非必需的基因，并通过分析逃逸突变体的基因组变化来进行验证。结果发现，靶向预测为非必需的基因（如orf93、orf94、orf162等）时，很容易获得大片段的缺失突变体；而靶向预测为必需的基因（如orf89、orf90、orf177）时，则只能获得点突变而非缺失，这有力地支持了TnSeq的预测。然而，这项验证工作也揭示了一个关键的技术局限 —— 极性效应。例如，尽管TnSeq数据显示编码归巢内切酶的orf72和orf179是必需的，但Cas13a靶向实验却能轻易获得它们的缺失突变体。深入分析表明，这两个基因位于多顺反子中，转座子的插入会阻断下游真正必需基因（如RNA聚合酶亚基）的转录，从而造成假阳性的必需性判断。这一发现凸显了ΦKZ基因组中存在的多个转录起始位点在缓冲极性效应中的重要作用，同时也证明了将Cas13a验证与TnSeq相结合的必要性。

在确认了核心必需基因集后，研究团队将重点转向了那些在标准实验室条件下看似非必需，但在特定生态或胁迫条件下可能至关重要的基因。为此，构建了一个包含约1,500个独立转座突变体的阵列化文库，并将其暴露于不同的环境压力下进行系统性筛选。当感染温度从标准的37°C降至18°C时，发现几个在高温下非必需的次要衣壳蛋白基因（如orf244和orf166）突变体的复制能力严重受损，其中orf244的突变体甚至完全无法在低温下形成噬菌斑，且这种缺陷可以通过回补orf244基因来挽救。冷冻电镜结构分析进一步揭示了这种条件性必需性的分子基础：gp244是一个装饰在衣壳外部的蛋白，可能在低温下起到稳定衣壳结构的作用。接着，通过将该阵列化文库分别涂布在表达不同类型抗噬菌体防御系统的细菌菌株上，鉴定出了多个参与噬菌体-防御系统军备竞赛的关键基因。最引人注目的发现是，一个携带nlp1基因（编码一种类似于T4噬菌体UvsX的重组酶）转座子插入的突变体，完全丧失了在表达III-C型CBASS系统（其效应器为NucC核酸酶）的菌株上复制的能力。通过构建精确的nlp1缺失突变体和互补实验，证明Nlp1的功能是修复由NucC造成的噬菌体DNA损伤，而非直接抑制CBASS系统本身。这一发现不仅阐明了ΦKZ对抗一种重要细菌免疫系统的全新策略，也解释了为何nlp1在常规TnSeq文库中虽然可以被插入，但其突变体在群体竞争中会因适应性劣势而被迅速淘汰。

为了更全面地捕捉这类影响适应性但非严格必需的基因，团队采用了时间分辨的TnSeq策略，即对转座文库在CRISPR-Cas13a选择压力下的不同时间点（0、5 、 20小时）进行取样测序。通过比较插入频率的动态变化，成功鉴定出一个包含15个基因的中间适应性类别，这些基因的突变体在选择初期尚能存活，但随着时间推移逐渐被淘汰。这些基因包括编码SF2家族解旋酶的orf75、编码与必需顶点结合复合体相关的衣壳蛋白的orf85，以及编码高拷贝内核蛋白的orf95和orf97等。对这些基因的后续验证表明，它们确实可以被敲除，但敲除后的突变体在与野生型噬菌体的直接竞争实验中表现出显著的适应性缺陷。最后，将这一强大的技术平台扩展到了更广泛的噬菌体种类。通过利用一种不依赖CRISPR的END核酸酶反选择系统，成功地在具有碱基修饰的YuA噬菌体中建立了转座诱变方法。对YuA的TnSeq分析揭示了一个与ΦKZ截然不同的遗传景观：在其58,663bp的基因组中，高达93%的注释基因（71/77）都被鉴定为必需或对适应性有重要贡献，仅有6个基因（约7%）是明确可有可无的。其中，一个编码GGDEF结构域蛋白的基因gp44，因其在非必需基因簇中表现出极低的插入耐受性和测序深度，被精准地识别为一个影响适应性的基因，这与它可能通过合成环二鸟苷酸来调节噬菌体行为的潜在功能相符。