NAR｜Sequential-GAM构建单细胞几何三维基因组结构|位点|基因组结|染色质|核内|细胞

染色质的三维（ 3D ）结构对细胞命运和基因调控至关重要。基因组在细胞核内折叠形成从染色体领地、 A/B 区室、亚区室到拓扑关联结构域（ TAD ）和染色质环的多层级 3D 结构。除拓扑结构外，基因组的几何特征 - 如表面积体积比、球形度以及径向位置与基因组功能密切相关。例如，基因从失活态转为激活态时，其核内径向位置往往发生重排【4-5】。然而，全基因组范围内层级化几何结构如何在单细胞水平组织仍知之甚少。

近日，清华大学高军涛、张奇伟教授等人，在 Nucleic Acids Research 上发表题为 Sequential-GAM constructs the single-cell geometric 3D genome structure 的研究论文。该团队开发了Sequential-GAM（ Sequential Genome Architecture Mapping）方法，通过对细胞核进行连续超薄切片并结合高通量测序，在单细胞水平构建了全基因组层级的几何3D结构，并系统揭示了染色体、区室、亚区室、TAD和基因在核内的径向分布规律及其结构稳定性与转录活性的关联。

研究背景：从拓扑3D基因组到几何3D基因组

近年来， Hi-C 及其衍生技术、 GAM （ Genome Architecture Mapping ）【1】、 SPRITE 等近端连接依赖或非依赖技术极大推动了 3D 基因组研究。然而，这些技术主要聚焦拓扑结构（即基因组位点间的空间接触关系），对基因组的几何特征 - 特别是单细胞水平的径向位置分布解析能力有限。 GAM 技术基于随机薄层核切片的 DNA 测序来捕获拓扑 3D 基因组结构。研究团队由此提出假设：如果对单个细胞的细胞核进行逐层连续切片，结合组成型核纤层相关结构域（ cLAD ）和线性基因组测序等约束信息，即可重建单细胞的基因组几何结构。

Sequential-GAM方法概览

Sequential-GAM 的工作流程如下。将细胞经多聚甲醛固定后包埋于明胶中，经蔗糖脱水后冷冻；随后使用冷冻超薄切片技术将细胞核切成连续的 200 nm 厚切片，并依次铺放于 PET 膜载玻片上。在显微镜下识别来自同一细胞核的连续切片后，利用激光显微切割并进行单细胞全基因组扩增和高通量测序。在计算方法上， Sequential-GAM 首先利用细胞的 SNP 信息将测序片段区分为母本和父本染色体；随后基于切片顺序确定每个位点沿 z 轴的坐标；再以 cLAD 为核边缘约束、以染色质 3D 空间距离与线性基因组距离之间的幂律关系【2】为约束，通过最大似然估计优化目标函数，最终重建每个染色体在单细胞中的几何 3D 结构。与 GAM 的随机切片相比， Sequential-GAM 的连续切片策略能以更高概率同时捕获同一细胞内的成对位点。

主要发现

团队利用 Sequential-GAM 系统解析了小鼠 ES 细胞基因组的三维径向组织规律。结果发现，不同染色体及表观基因组特征具有明确的径向定位模式：活跃染色质和早期复制区域更靠近核中心，而异染色质、晚期复制区域及核纤层相关区域主要分布于核外周，揭示了核内功能分区与空间组织密切相关。进一步分析发现， A/B 区室及亚区室沿核中心至核外周形成连续的径向定位梯度，并在单细胞水平表现出一定的动态异质性。同时，研究鉴定了具有稳定空间构型的准稳定 TAD （ q-stable TADs ），其空间稳定性与亚区室组成及较低的转录活性密切相关。在基因水平，高表达基因更倾向于定位于核内侧，并表现出更大的径向位置变异；而低表达基因则更多分布于核外周。整体而言，研究表明基因组的三维径向组织与染色质状态、染色体区室结构及基因转录活性之间存在紧密联系，为理解核内空间组织的功能意义提供了新的认识。

总结与展望

综上所述， Sequential-GAM 能够估计单细胞水平基因组几何 3D 结构，并揭示其结构稳定性与细胞间异质性。该研究的主要贡献包括：（ 1 ）开发了基于连续核切片的单细胞几何 3D 基因组构建方法；（ 2 ）系统描绘了染色体、表观基因组特征、区室 / 亚区室的径向梯度分布；（ 3 ）定义并表征了 q-sta ble TADs ，揭示其结构稳定性与转录活性的关联；（ 4 ）发现基因的径向距离及径向位置稳定性均与基因表达呈负相关。该工作也存在一定局限，未来通过优化实验流程、结合高通量测序技术、将核形状建模推广至椭球或可变形几何体，并将 Sequential-GAM 与单细胞 RNA-seq 直接偶联，有望进一步提升生物学解释。此外，将 Sequential-GAM 与组织水平的全基因组免疫标记相结合，可望推动更高维度的原位单细胞基因组几何分析。

该工作第一作者为博士研究生李永歌、王开丽同学。致谢北京大学钱敏平教授、清华大学颉伟教授、清华大学李海涛教授在讨论中的建议和帮助，致谢清华大学冷冻电镜平台的李英博士、清华大学博士后李亚书、团队成员马紫珊、严琰、孟乐元、苏昊晨等人，在实验和数据分析中的帮助。

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkag794

制版人：十一

参考文献

1. Beagrie RA, Scialdone A, Schueler M et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.Nature2017;543:519–24. doi:10.1038/nature21411

2. Nagano T, Lubling Y, Varnai C et al. Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.Nature2017;547:61–7. doi:10.1038/nature23001

学术合作组织

（*排名不分先后）