代理bluesens尾气分析仪在恒化培养实验装置中的应用|反应器|培养基|实验|尾气分析仪|甘油

引言

细胞培养是几乎所有生物技术生产工艺中最重要的单元操作。因此，发酵培养过程的测量、监测与控制，一直是工业界与科研界持续关注的课题。

生物量代表工艺的有效产出，是最受关注的参数之一。目前已经开发出众多测量生物量浓度的技术，分别采用不同物理原理、数学模型，或将二者结合，Olsson L.(1997)对此做过综述。

我们评估了摄氧速率(OUR)与二氧化碳释放速率(CER)，将其作为生物量软件传感器的潜在输入参数，该研究思路由Petkov 和 Davis(1996)提出。本研究的研究对象为毕赤酵母，我们以甘油或葡萄糖作为碳源，在恒化培养条件下确定模型所需系数。得到的生物量变化模型，在分批发酵与标准补料分批发酵中完成测试。

该方案可使所有配备尾气分析仪的生物反应器受益，无需使用侵入式生物量传感器。该方法同时契合“过程分析技术”（PAT）的目标，通过量化我们的“细胞工厂”，实现对工艺质量的监测。

设备组装

本研究采用5.0 L生物反应器系统（Minifors，Infors，瑞士巴塞尔‑波特明根；见图1）开展培养实验。

相较于标准配置，该系统做了拓展：接入补料、放料、耗碱量的称重信号；配备Vögtlin（瑞士埃施）空气质量流量控制器用于供气；搭载BlueSens（德国赫尔滕）的BlueInOne尾气分析仪，用于检测二氧化碳浓度、氧气浓度、绝对湿度以及温度。

模拟信号直接接入生物反应器I/O输入端口，在IRIS（Infors）监控软件中锁定为工艺参数。

图1：恒化培养实验装置。1.补料称重模块，2.放料称重模块，3.生物反应器，4.BlueInOne尾气分析仪**

材料与方法

本研究使用毕赤酵母SMD1168H（蛋白酶缺陷型）菌株。

种子培养：摇瓶装入100 mL YPG培养基（每升含10 g酵母提取物、10 g蛋白胨、10 g甘油），接入毕赤酵母菌株；28 ℃、180 r/min振荡培养约24 h。将该种子液接种至生物反应器，初始光密度OD=2.0。

培养温度控制为25 ℃；添加25%氨水将pH稳定在5.85；通过调节搅拌转速250‑1200 r/min、进气流量4.2‑15.0 L·min⁻¹，使溶解氧饱和度维持在20%以上。

合成培养基分批、恒化、补料分批培养基参照Maurer等人(2006)的文献，仅碳源替换为甘油或葡萄糖。恒化培养的比生长速率设置为0.025‑0.15 h⁻¹。每经过5个停留时间后采集稳态样品。补料分批发酵按照Gasser等人(2006)的标准方案执行，补料速率恒定为9.25 g补料培养基·L⁻¹发酵液·h⁻¹。

生物量测定：取5 mL发酵液离心，沉淀用蒸馏水洗涤一次，转移至预先称重的烧杯中。烧杯置于105 ℃烘干至恒重。所有样品均做平行双样分析。

计算方法

摄氧速率OUR（单位g·h⁻¹），依据理想气体状态方程(1)，结合进出口氧气浓度差计算得到。

二氧化碳释放速率（CER）单位[g·h⁻¹]，通过进出口二氧化碳浓度差值进行计算。

由于仅对进气流量F AIR,in进行测量与控制，排气流量F AIR,out必须基于氮元素衡算做补偿计算：

其余参数包括：压力* p [kPa]，氧气摩尔质量M_O₂ = 32.00 [g mol⁻¹]，二氧化碳摩尔质量M_CO₂ = 44.00 [g mol⁻¹]，理想气体常数R = 8.314472 [J mol⁻¹ K⁻¹]以及温度* T [K]（*……由BlueInOne测得）。

结果与讨论

本研究分别基于氧衡算和好氧生长条件下的碳衡算进行生物量预测（Petkov and Davis 1996）。

稳态条件下，方程(4)与(5)可列写如下：

在恒化培养条件下通过实验测定了摄氧率（OUR）、二氧化碳释放率（CER）与比生长速率μ之间的相互关系（图2）。OUR随μ的变化关系以及CER随μ的变化关系由公式(6)和(7)描述。氧气维持系数m_O/X、二氧化碳维持系数m_CO/X，以及氧气得率系数Y_X/O、二氧化碳得率系数Y_X/CO的数值均通过最小二乘法求得：调整m_O/X和Y_X/O参数，使实验数据的偏差平方和达到最小值，同时附加参数必须大于零的约束条件。相关结果汇总于表1。