Mol Cell | Maria Pia Cosma/孙红燕开发HoT自闪烁探针，实现活细胞与组织中染色质的实时超分辨成像|dna|位点|孙红燕|探针|染色质|细胞|荧光

细胞核内DNA的三维高级结构与基因表达调控、细胞命运决定及肿瘤发生密切相关。然而，在活细胞中以纳米级分辨率实时观察染色质的组织结构与动态变化，长期以来是一项极具挑战性的技术难题。单分子定位显微镜（SMLM）如STORM、PALM等虽然能够突破光学衍射极限，实现约20纳米的定位精度，但传统SMLM染料往往需要高激光功率、还原性缺氧缓冲环境，且细胞膜通透性差，难以应用于活细胞成像。现有DNA标记手段同样存在局限：FISH探针仅适用于固定细胞，EdU/EdC等核苷类似物只能标记复制期DNA，Hoechst、DAPI等常规DNA染料则缺乏SMLM所需的光开关特性。因此，开发一种简单、高效、可穿透活细胞膜的自闪烁DNA探针，对于在生理条件下研究染色质结构与功能具有重要意义。

近日，广东省人民医院与CRG Cosma教授团队联合香港城市大学孙红燕教授团队，在Molecular Cell在线发表了题为HoT Auto-Blinking Probes Enable Real-Time,Super-Resolution Chromatin Imaging in Live Cells and Tissues的技术研究论文。该研究通过对罗丹明螺内酰胺的开环平衡进行精细结构调控，开发了一系列名为 HoT（Hoechst-6-TAMRA衍生物）的自闪烁DNA探针，实现了在活细胞、固定细胞及组织切片中对染色质的免清洗、无添加剂、长时间实时超分辨成像，并在干细胞鉴定、视网膜再生研究及结肠癌临床样本分析等多个场景中展示了广泛的应用潜力。

一、HoT 探针的设计与光物理特性：精准调控罗丹明螺环化实现最优自闪烁

研究团队将具有可调开环平衡的罗丹明与Hoechst（特异性结合DNA小沟）偶联，合成了四种HoT探针—HoT-C 4 、HoT-CF 3 、HoT-2CF 3 和HoT-SO 2 ，通过在罗丹明母核上引入不同电子效应的取代基（如丁基、三氟甲基、双三氟甲基、磺酰胺基），精确调控探针在结合DNA小沟后的开环/闭环平衡，从而系统地研究了螺环化倾向对SMLM成像性能的影响。

单分子分析表明，只有具有中等开环倾向的HoT-CF 3 和HoT-2CF 3 在活细胞中表现出稳健的自闪烁行为，无需任何添加剂即可实现清晰的单分子闪烁。开环比例过低（如HoT-C 4 ）导致闪烁事件不足，而开环比例过高（如HoT-SO 2 ）则引起信号重叠和更快的光漂白。这一结果揭示了 "中等 on-state 比例" 对于高密度 DNA SMLM 成像的关键意义。

在光物理性能方面，HoT-CF 3 和HoT-2CF 3 均表现出优异的光稳定性，在连续10,000帧成像后分别保留95%和86%的初始荧光。两者的平均亮态持续时间约95毫秒，每次开关事件的光子数分别高达1370和2460，而占空比仅为0.007和0.0043，这些特性使其非常适合STORM 成像并能在致密染色质中实现精确定位。与已报道的SMLM DNA探针（包括5-HMSiR-Hoechst、JF646-Hoechst、JF549-Hoechst和Cy5-Hoechst）相比，HoT-CF 3 和HoT-2CF 3 在相同成像条件下提供了更低的背景、更高的信噪比和更低的信号重叠率，定位精度均优于20纳米。

此外，HoT探针的荧光增强由双重机制驱动：一是螺内酰胺开环产生荧光，二是DNA结合后解除Hoechst介导的荧光淬灭。这种双重turn-on机制大幅降低了背景荧光，加之该探针凭借其合理的分子结构设计，还具备自组装特性和良好的膜通透性。CCK-8细胞毒性实验证实，探针在1.25-20 µ M浓度范围内均具有高生物相容性。

二、活细胞STORM成像：揭示染色质纳米级组织结构

利用HoT-CF 3 和HoT-2CF 3 对活HeLa细胞和人成纤维细胞（hFib）进行染色后，研究团队获得了高对比度的DNA超分辨图像。STORM密度渲染图清晰显示，致密的异染色质区域主要分布于核周，并与核纤层蛋白Lamin A/C共定位，符合核纤层相关异染色质的特征；而核内部的常染色质区域则表现出较低DNA密度。HoT-CF 3 在活细胞和固定细胞中均实现了约19-22纳米的平均定位精度，HoT-2CF 3 则为约21-24纳米。通过与EdC-AF647和Hoechst的共定位分析（Pearson 相关系数分别高达0.94-0.97和0.85-0.90），进一步证实了探针对DNA的高度特异性。

三、3D活细胞成像与MINFLUX：从三维结构到纳米级分辨率

为了获取更完整的结构信息，研究团队利用VUTARA VXL超分辨系统 HoT标记的活HeLa细胞进行了3D SMLM成像，捕获了染色质纤维的高分辨率三维结构，并从 0°、 45°、 90°、135°、180°等不同角度渲染展示，揭示了核周与核内部区域之间染色质压缩程度的差异。HoT-2CF₃在 X 、 Y、Z 轴上的中位定位精度分别达到25.0 nm、24.4 nm和79.7 nm，HoT-2CF 3 则为20.0 nm、19.6 nm和69.8 nm。在长达15,000帧的成像过程中，每帧检测到的闪烁分子数保持稳定（平均45-49个/帧），体现了探针优异的时间稳定性和低光毒性。

更进一步，研究团队将HoT探针与MINFLUX超分辨显微镜结合，在固定细胞中实现了前所未有的DNA纤维分辨率。 2D MINFLUX 成像的中位定位精度达到X轴2.97 nm、Y轴3.12 nm；3D MINFLUX则在X、Y、Z轴分别达到6.35 nm、5.74 nm和4.47 nm。基于密度峰的聚类分析揭示了核周与核内部染色质组织的显著差异：核周染色质结构域面积更大（中位数889.4 nm²vs. 152.7 nm²）、每个结构域包含更多定位（中位数6 vs. 2）、结构域间最近邻距离更小（中位数37.2 nm vs. 43.1 nm），从定量层面证实了核周染色质更为致密的组织特征。此外，对组蛋白H2B的MINFLUX成像也实现了2.4-2.88 nm的定位精度，揭示了核小体clutch之间约60 nm的间距，与已有报道高度一致【1】。

四、活细胞延时成像：追踪染色质纤维的动态变化

HoT-2CF 3 的高时间分辨率使其能够用于活细胞延时STORM成像，实时追踪染色质纤维的运动。研究团队用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理细胞，以诱导全局染色质松散化，并通过单粒子轨迹分析量化了DNA纤维的动力学参数。基于广义扩散模型 ⟨ r 2 ( τ ) ⟩ = 4 D α τ α 的拟合结果显示，TSA处理显著降低了HeLa和hFib细胞中的扩散系数Dα，并在HeLa细胞中显著降低了异常指数α，表明染色质松散反而导致了更慢、更受约束的亚扩散运动。这一发现挑战了“染色质松散必然导致运动自由度增加”的传统假设，提示染色质解压缩可能通过改变核内拥挤环境或组蛋白-DNA静电相互作用，在纳米尺度上降低染色质动态性。

五、干细胞鉴定与AI辅助分类：从活细胞DNA结构识别细胞身份

核小体clutch的大小与细胞多能性密切相关。Cosma研究团队此前开发了基于超分辨成像数据训练的人工智能算法AINU（Artificial Intelligence of the Nucleus）【2】，用于从染色质结构特征中识别细胞类型。在本研究中，团队利用HoT探针对活的hFib细胞及其来源的诱导多能干细胞（hiPSC）进行染色，发现活hiPSC的DNA密度显著低于hFib细胞，与固定细胞中的先前结果一致。更重要的是，用HoT-2CF 3 标记的活细胞DNA超分辨图像训练AINU后，该模型在5折交叉验证中对hFib和hiPSC的分类准确率分别达到0.96和0.98，在独立测试集上的平均F1值为0.97±0.02，AUC高达1.00±0.00。这一结果表明，HoT探针结合AI分析有望在再生医学中实现对高质量多能性干细胞的鉴定。

六、基因位点以及染色质环境成像：OligoSTORM与HoT的双色联用

为了将特定基因位点置于其所在的染色质环境中进行观察，研究团队将HoT-CF 3 的全基因组 DNA标记与OligoSTORM技术结合，对hiPSC和hFib细胞中的 OCT4-TCF19 基因位点（20 kb）进行了双色超分辨成像。 OCT4-TCF19 在hiPSC中处于活跃状态，而在hFib中被抑制。结果显示，该基因位点在hFib中位于更致密的染色质区域内，而在hiPSC中则处于较开放的染色质环境中。Voronoi分析进一步定量证实了hiPSC中该区域定位密度的降低。这一应用展示了HoT探针作为“染色质背景画布”，与基因特异性标记技术联用，在基因组三维结构研究中的独特价值。

七、组织切片中的应用：从视网膜再生到结肠癌临床样本

HoT 探针的组织穿透能力使其能够在复杂的组织环境中实现超分辨成像。在斑马鱼视网膜冷冻切片中，研究团队用NMDA诱导视网膜损伤后，利用HoT成功对视网膜外核层（ONL）的感光细胞和内核层（INL）的各类神经元进行了DNA超分辨成像，并通过PCNA共标记识别了增殖中的 Müller 胶质细胞（斑马鱼视网膜再生的来源细胞）。研究人员利用GFAP（glial fibrillary acidic protein）启动子驱动GFP表达，特异性标记Müller胶质细胞，并对转基因斑马鱼视网膜切片进行HoT染色和DNA成像。结果发现，与其他视网膜神经元相比，Müller胶质细胞的DNA密度较低。HoT-CF 3 和HoT-2CF 3 在视网膜切片中的平均定位精度分别达到15 nm和20 nm。

在临床转化方面，研究团队将HoT-CF 3 应用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人结肠癌组织切片。令人瞩目的是，探针在石蜡切片中仍保持优异的自闪烁性能，平均定位精度达24 nm，实现了对正常和癌旁组织中核内染色质结构的纳米级可视化。定量分析显示，癌组织中的染色质密度显著低于相邻正常区域，提示肿瘤进展过程中染色质结构可能趋于松散。这些结果凸显了HoT探针在临床样本纳米级染色质成像中的应用潜力，并提示染色质结构特征有望作为恶性肿瘤的潜在生物标志物。

总结与展望

本研究通过对罗丹明螺内酰胺开环平衡的精细结构调控，开发了HoT系列自闪烁DNA探针。其中HoT-CF 3 和HoT-2CF 3 兼具高光子产额、低占空比、优异光稳定性、高时间分辨率、良好膜通透性和低背景等优势，能够在免清洗、无添加剂的条件下实现活细胞、固定细胞及组织切片中染色质的长时间实时超分辨成像。借助这些探针，研究团队不仅在STORM和MINFLUX 平台上揭示了染色质的纳米级三维组织结构与动态特征，还在干细胞AI鉴定、基因位点染色质环境成像、视网膜再生研究及结肠癌临床样本分析等多个场景中展示了广泛的应用价值。

该工作的模块化设计策略——将 DNA 靶向特异性与SMLM所需的光物理特性相结合—— 为下一代自闪烁探针的开发奠定了基础。未来，通过将HoT框架与核酸适体、CRISPR靶向模块等整合，有望开发出兼具全局和靶向双重结合模式的探针；通过引入不同蛋白或RNA靶向基团，可将这一自闪烁策略拓展至更多细胞内靶标的超分辨成像；而与 MINFLUX等更高分辨率技术的深度结合，则有望进一步提升时间分辨率，实现对超快染色质动态过程的实时追踪。总体而言，HoT探针为在活细胞和组织的原生环境中研究染色质结构与功能提供了强大而通用的工具，其应用范围涵盖从基础细胞生物学到癌症诊断、再生医学等多个领域。

本研究由广东省人民医院、西班牙基因组调控中心CRG、ICREA、庞培法布拉大学 Maria Pia Cosma 教授团队（通讯作者）、香港城市大学孙红燕教授团队（通讯作者）合作完成，Cosma团队王爱萍博士为第一作者，香港城市大学张捷博士为通讯作者，香港城市大学刘山山、施恒为共同第二作者。CRG 博士后 Mikhail Rotkevich 以及 Carlotta Viana 也为本研究工作付出了重要的贡献。

https://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(26)00557-5

开放获取：

https://authors.elsevier.com/a/1nh683vVUPZOr7

制版人：十一

参考文献

1. Ricci, M.A., Manzo, C., García-Parajo, M.F., Lakadamyali, M., and Cosma, M.P. (2015). Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo.Cell160, 1145–1158. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.01.054

2. Carnevali, D., Zhong, L., Gonzalez-Almela, E., Viana, C., Rotkevich, M., Wang, A., Franco-Barranco, D., Gonzalez-Marfil, A., Neguembor, M.V., Castells-Garcia, A., et al. (2024). A deep learning method that identifies cellular heterogeneity using nanoscale nuclear features.Nat Mach Intell6, 1021–1033. https://doi.org/10.1038/s42256-024-00883-x

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