STM丨ALDH3B2功能缺失促进人胰腺导管细胞向胰岛β样细胞转分化，为内源性β细胞再生提供潜在新靶点|β样细胞|β细胞|内源性|导管细胞|心血管疾病|胰岛素|胰腺

糖尿病的发生和进展虽然涉及多种不同的病理机制，但无论是1型糖尿病还是2型糖尿病，功能性胰岛β细胞数量不足都是疾病发生发展的核心环节之一。因此，如何恢复足够数量并具有正常功能的胰岛β细胞，一直是糖尿病研究和再生医学领域的关键目标。目前，利用供体胰岛或由人胚胎干细胞、诱导多能干细胞分化获得的胰岛样细胞进行移植，已经为恢复β细胞功能提供了重要路径。然而，细胞移植后临床上仍面临免疫排斥、长期免疫抑制以及细胞来源等问题。因此，另一项极具吸引力的策略：是直接利用患者自身胰腺中已经存在的细胞，通过诱导细胞命运转变，实现内源性β细胞再生。

成年胰腺β细胞可以通过自身复制或由其他胰腺细胞类型转分化而得到再生。在啮齿类动物中，β细胞自身复制被认为是β细胞扩增的主要机制，但成年人的β细胞增殖能力非常有限。另一方面，越来越多的人体研究提示，胰腺导管上皮中可能存在一定程度的β细胞新生现 (Neogenesis)。例如，在胰岛素抵抗、妊娠以及局部胰腺损伤等情况下，人胰腺导管区域能够观察到胰岛素阳性细胞；近年来的活体胰腺切片研究也进一步提示，成年人的导管细胞可能具有一定程度的内分泌细胞可塑性。然而，这种自然发生的导管细胞向β细胞转分化效率很低，其分子调控机制也仍不清楚。因此该领域一直有一个核心问题：能否找到决定这种细胞命运转变的关键因子，显著提高人胰腺导管细胞向β细胞转分化的效率，从而可以有潜力成为临床糖尿病治疗方法？

近日，Science Translational Medicine发表来自Harvard Medical School, Joslin Diabetes Center,Peng Yi’s lab. (伊鹏课题组) 的研究，题为：Loss of function of ALDH3B2 transdifferentiates human pancreatic duct cells into β-like cells。

围绕上述问题，团队建立了一个基于胰岛素启动子活化的全基因组CRISPR敲除筛选体系，系统寻找调控人胰腺导管细胞向β细胞转分化的基因。筛选覆盖约19,000个人类基因，通过富集胰岛素启动子被激活的细胞，并结合NGS测序和MAGeCK分析，他们获得了一系列候选调控因子。其中，ALDH3B2的作用尤为突出：当ALDH3B2缺失导致导管来源的PANC-1细胞出现明显的胰岛素表达增加，同时导管细胞标志物KRT19改变。ALDH3B2属于醛脱氢酶家族，而这一家族长期以来被认为与干细胞状态和细胞命运决定密切相关。更重要的是，ALDH3B2本身是一种酶，因此从转化角度看，它不仅可以通过基因编辑进行干预，也具备将来进一步开发小分子抑制剂的潜力。

进一步对这一基因进行了系统研究，ALDH3B2缺失并不只是简单地激活胰岛素启动子，而是能够推动细胞发生更加全面的转变。ALDH3B2缺失后，细胞中PDX1、MAFA等多个β细胞关键转录因子的表达显著升高，胰岛素以及与葡萄糖感知、胰岛素分泌相关的多种功能基因也明显增加。免疫荧光结果显示，ALDH3B2突变细胞可以表达胰岛素和C肽；电子显微镜进一步观察到具有典型结构特征的胰岛素分泌颗粒以及更加丰富的内质网结构。利用可诱导的shRNA降低ALDH3B2表达同样能够获得类似结果，进一步排除了单一CRISPR向导RNA脱靶效应的可能性。这些结果说明，ALDH3B2功能降低所诱导的并非单一基因表达变化，而是导管细胞向β细胞样状态的整体性重编程。

由于肿瘤来源的PANC-1细胞主要用于遗传筛选和靶点发现，随后将研究重点转向成人原代人胰腺导管细胞。这些细胞来自人供体胰岛分离后剩余的胰腺组织，并经过纯化获得。与人原代胰岛相比，纯化后的导管细胞几乎不表达胰岛素，而高表达导管细胞标志物KRT19。值得注意的是，ALDH3B2在人胰岛中的表达本身就显著低于导管细胞。降低原代人胰腺导管细胞中的ALDH3B2后，PDX1、MAFA、胰岛素、葡萄糖激酶以及ATP敏感性钾通道相关基因均显著上调；大约6%的细胞在培养6天后已经能够检测到胰岛素蛋白。电子显微镜同样可以在这些细胞中观察到胰岛素分泌颗粒。

团队还进一步分析了这一细胞命运转换是否伴随着更加稳定的表观遗传学变化。结果显示，在ALDH3B2缺失的人原代胰腺导管细胞中，人胰岛素基因多个经典CpG位点的DNA甲基化程度明显下降，并向人胰岛细胞中的低甲基化状态转变。考虑到整个细胞群体中只有一部分导管细胞真正发生了转分化，这种在混合细胞群体中仍然能够检测到的甲基化改变说明，ALDH3B2缺失所诱导的β细胞样状态并非单纯的短暂基因激活，而可能涉及较为稳定的细胞命运重塑。

随后，他们利用糖尿病小鼠移植实验直接检测这些细胞在体内是否具有功能。原代人胰腺导管细胞接受ALDH3B2基因编辑后，被移植到糖尿病小鼠肾包膜下。移植后数天后，接受ALDH3B2缺失导管细胞的小鼠血糖便开始明显下降；3周左右，小鼠血糖降低至接近正常范围，而且可以受到葡萄糖调控。组织学分析进一步发现，只有ALDH3B2缺失组能够观察到胰岛素、C肽、PDX1和NKX6.1阳性细胞。在成功接受基因编辑载体的导管细胞中，大约10-15%的细胞最终表达胰岛素。值得注意的是，大量细胞同时表达PDX1和KRT19，这种表达模式具有胰腺祖细胞样特征，说明ALDH3B2缺失可能首先推动成熟导管细胞进入一种更加可塑的祖细胞样状态，随后其中一部分细胞进一步向β细胞方向分化。

为了更加清楚地解析这一转分化过程，对ALDH3B2缺失以及对照人原代胰腺导管细胞进行了单细胞RNA测序。在对照组中，胰岛素阳性细胞极少，仅占约0.8%；而在ALDH3B2缺失后，胰岛素阳性细胞比例增加至约8.5%，并分布于多个不同的细胞亚群中。这些细胞一方面表达INS、CHGA、IAPP、SLC30A8、PAX6等β细胞或内分泌细胞相关基因，另一方面仍然保留KRT17、KRT19和KRT23等导管细胞特征，提示它们处于从导管细胞向β细胞逐渐转变的不同阶段，而不是一次性完成细胞身份转换。

进一步结合拟时序分析、RNA速度分析以及PAGA细胞轨迹分析，重建了ALDH3B2缺失后导管细胞向β细胞样细胞发展的动态过程。多种分析方法均支持这样一个模型：部分导管细胞首先进入具有较高转分化潜力的中间状态，随后经过具有导管和内分泌双重特征的过渡细胞群，最终向表达较高水平胰岛素及成熟内分泌标志物的β细胞样状态发展。这一过程中伴随着显著的代谢和信号通路重塑，包括糖酵解、TGF-β相关信号以及钙离子信号等。进一步的药理学验证显示，抑制糖酵解可以显著阻断ALDH3B2功能降低所诱导的导管细胞向β细胞转分化，说明代谢重塑，特别是糖酵解通路改变，可能是导管细胞获得β细胞命运的重要前提之一。

从转化医学角度来看，ALDH3B2具有一个值得关注的特点：它是一种酶，因此理论上可以通过药物进行调控。研究发现，广谱醛脱氢酶抑制剂DEAB可以部分重现ALDH3B2缺失所引起的细胞转分化，但是将来可能需要筛选具有更高选择性的ALDH3B2小分子抑制剂，从而通过药理学方式促进患者自身胰腺导管细胞向β细胞转分化。当然，目前获得的β样细胞在成熟程度、葡萄糖刺激胰岛素分泌能力以及整体转分化效率方面仍然不能与成熟人β细胞完全相比，因此如何进一步提高细胞转换效率和成熟度仍是下一阶段的重要问题。

总体而言，本研究通过全基因组CRISPR筛选首次揭示ALDH3B2这一新的胰腺导管细胞命运调控因子，并在人原代胰腺导管细胞中证明，降低ALDH3B2功能可以诱导导管细胞向具有胰岛素分泌功能的β细胞样细胞转分化；这些细胞在移植至糖尿病小鼠后能够分泌人胰岛素并显著改善高血糖。单细胞转录组和细胞轨迹分析进一步揭示了导管细胞经过中间状态逐渐获得β细胞身份的动态过程，并指出糖酵解相关的代谢重编程是这一细胞命运转换的重要机制。这些发现进一步支持了成人人胰腺导管细胞具有可被人为调控的细胞可塑性这一观点。未来治疗糖尿病可能不仅可以依赖从体外制备和移植新的β细胞，还可能通过靶向患者自身胰腺内的细胞，在体内诱导新的功能性β细胞产生。ALDH3B2因此可能成为推动内源性胰岛β细胞再生研究和糖尿病再生治疗发展的一个新的候选靶点。

本论文Jian Li (李建) 为第一作者; 李建和伊鹏研究员为共同通讯作者。

https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.ady2234

制版人：十一

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（*排名不分先后）