Adv Sci｜罗鹏/出良钊/苏敏/罗荣灿/陈忠良建立高效、可规模化培养人脉络丛类器官培养体系|出良钊|细胞|罗荣灿|罗鹏(1975年)|脉络|苏敏|陈忠良

脉络丛（ Choroid plexus, ChP ）是脊椎动物大脑关键功能组织，负责分泌脑脊液（ Cerebrospinal fluid, CSF ），构筑血 - 脑脊液屏障（ Blood-cerebrospinal fluid barrier, B-CSF-B ），调控营养转运、免疫监视、神经发生与突触成熟等过程，在大脑发育和维持稳态中发挥重要作用，并在阿尔茨海默病（ Alzheimer ’ s disease, AD ）、脑积水、中枢病毒感染等多种神经系统疾病的发生发展中扮演重要角色。人体脉络丛组织难以获取，而类器官（Organoids）为研究脉络丛提供了良好的体外模型。现有类器官构建方案大多聚焦利用蛋白或小分子化合物调控发育相关信号通路，忽视了干细胞培养微环境（生态位，niche）对细胞谱系分化的重要作用。而且，高效、稳定的人源脉络丛体外模型仍然十分匮乏。

近日，贵州医科大学联合兰州大学在Advanced Science期刊发表了题为NicheMediated Neural Priming Enables Robust and Scalable Generation ofHuman Choroid Plexus Organoids的研究文章。该研究利用干细胞生态位介导的神经预启动（ Neural Priming ）策略，大幅提升了人脉络丛类器官诱导效率（约 68% ），获得兼具上皮 - 间质结构的新类器官模型，为人脉络丛发育、脑脊液功能、神经疾病及病毒感染研究提供了新工具。

1. 将 hESCs 的培养基由 E8 转换成 mTeSR1 可大幅提高 ChP Organoids 的形成效率

本研究中，作者在构建皮肤类器官的实验过程中偶然观察到少量脉络丛类器官（ ChP Organoids ）的形成，但发生率不足 3% 。考虑到皮肤、脉络丛均起源于外胚层，且脉络丛上皮源自神经上皮细胞。如果提高人胚胎干细胞（ human Embryonic Stem cells, hESCs ）的神经分化倾向，增加神经上皮细胞的生成比例，能否提高脉络丛类器官的诱导效率。

基于上述设想，团队改变人胚胎干细胞维持培养基，即将 E8 培养基替换为能增加神经细胞分化倾向的 mTeSR1 培养基，经过 5 代培养，使细胞进入神经预启动（ Neural Priming ）状态。结果显示，脉络丛类器官诱导效率从不足 3% 提升至约 68% 。该类器官呈 “ 树状 ” 结构，树冠区域为极化的脉络丛分泌上皮，高表达 AQP1 、 TTR 等标记蛋白；主干为间质，高表达 COL1A1 、 LUM 等标记蛋白；且上皮包裹间质，与体内脉络丛组织构型相似。

2. ChP Organoids 分泌类脑脊液，其内蛋白组成和体内脑脊液相似

脉络丛的一个重要功能是分泌脑脊液（ Cerebrospinal fluid, CSF ），后者对于大脑发育和维持稳态都至关重要。该类器官模型虽不具备封闭腔室，但也能分泌类脑脊液（ CSF-like fluid, iCSF ），且可实现非损伤、多次收集 iCSF 及其外泌体。蛋白组学证实 iCSF 及其外泌体的蛋白组分与人天然脑脊液及其外泌体高度相似，同时也检出了多种神经系统疾病相关生物标志物。转录组分析表明该类器官具备多脑室脉络丛混合身份，可能以第四脑室（后脑）脉络丛为主；且高表达 ACE2 、 NRP1 ，对 SARS CoV 2 易感，高度模型体内脉络丛。

3. 将 E8 培养基转换为 mTeSR1 增强了 hESCs 的神经分化势能

为了进一步研究 mTeSR1 增强脉络丛类器官诱导效率的分子机制，作者进行了转录组测序，发现 mTeSR1 培养会抑制 WNT 与 TGF-β 信号通路活性，但上调神经分化相关信号通路，如 “ the neuroactive ligand-receptor interaction pathway ” ，从而增强人胚胎干细胞的神经分化倾向。

4. mTeSR1 培养条件下 hESCs 分化为神经上皮细胞的能力增强，从而显著提高了 ChP Organoids 的诱导分化效率

接下来，作者在定向分化或是在皮肤类器官诱导培养条件下验证 mTeSR1 是否促进 hESCs 往神经细胞分化。结果发现，在上述两种情况下， mTeSR1 培养的人胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的能力明显增强，而脉络丛上皮又源自神经上皮细胞。另外，有研究表明， BMP4足以驱动人胚胎干细胞来源的神经上皮祖细胞分化为脉络丛上皮细胞。巧合的是，皮肤类器官诱导培养体系中就含有 BMP4 ，这可能也是脉络丛类器官形成效率大幅提升的原因之一。延长分化实验证实早期脉络丛发育标记基因 OTX2 、 MSX1 逐步上调，驱动细胞向脉络丛谱系特化。

综上所述，该研究发现在皮肤类器官诱导培养过程中会形成非常少量的脉络丛类器官。皮肤和脉络丛均源自外胚层，且脉络丛上皮由神经上皮细胞发育而来。将人胚胎干细胞（ hESCs ）的培养基从 E8 转换为 mTeSR1 ，可显著增强 hESCs 的神经分化倾向，并提高了神经上皮细胞的分化比例，最终大幅提升了脉络丛类器官（ ChP organoids ）的诱导效率。该类器官模型为人脉络丛发育解析、脑脊液功能研究以及神经系统疾病建模提供了新的实验平台。该研究证实干细胞扩增阶段的培养微环境能够预先塑造细胞谱系倾向性，为高效构建其它组织来源的类器官提供了新的思路。