Cell | 结构域重组的合成转录因子重编程CAR-T细胞，突破抗肿瘤功能极限|t细胞|亚群|位点|结构域

撰文|细胞工程师

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤中取得了革命性成功，但仍有大量患者面临疗效持久性不足、肿瘤复发和T细胞耗竭等问题【1】。如何通过基因工程手段将CAR-T细胞重编程为更持久、更高效的治疗状态，是领域内亟待突破的核心难题。转录因子（Transcription f actor , TF）作为基因表达的控制开关，是重塑T细胞状态的关键工具，但天然转录因子的功能受进化约束，往往难以同时优化多个治疗相关性状。

近日，斯坦福大学 Ansuman T. Satpathy 与 Theodore L. Roth 领导的研究团队在 Cell 杂志上发表题为 Synthetic transcription factors designed by domain recombination enhance CAR T cell antitumor function 的研究论文。该研究开发了名为DESynR（Domain Engineered via Synthesis and Recombination）的合成生物学平台，通过系统性重组转录因子的天然结构域，在体外构建了数万个非天然存在的合成转录因子，并从中筛选出能显著增强CAR-T细胞抗肿瘤功能的候选分子。其中，合成AP-1转录因子 JUN-FOS-BATF 在多种临床前模型中展现出超越天然转录因子的强大抗肿瘤活。机制研究表明， DESynR 转录因子并非通过改变基因组结合位点，而是通过差异性地调控共结合位点的转录输出，将CAR-T细胞重编程为兼具强效细胞毒性与持久记忆特征的功能状态。

人类蛋白质编码基因的起源并非无中生有，而是通过祖先蛋白结构域的添加、删除或重排逐步演化而来。受这一进化原理的启发，研究团队设计了DESynR平台，将某一转录因子家族中所有成员的结构域按照 “ N端结构域—DNA结合结构域（DBD）—C端结构域 ” 的三段式架构进行系统性重组，通过迭代克隆和条形码标记，在质粒文库中构建了数以万计的合成转录因子。研究团队以AP-1转录因子家族为起点，从24个天然AP-1家族成员（涵盖 FOS 、 JUN 、 ATF 和 MA F四个亚家族）中提取了N端、 bZIP（DNA结合）和C端结构域共 72个结构域，组装成13824种DESynR AP-1转录因子。在CD19-28ζ CAR-T细胞的慢性刺激筛选模型中， 242种DESynR AP-1转录因子显著富集，其中53种的促增殖/持久性能力超过了表现最优的天然AP-1转录因子 JUNB 。结构域使用偏好分析显示， FOS 亚家族的N端结构域、序列高度相似的 ATF3 和 JDP2 bZIP结构域，以及 BATF / BATF3 的C端结构域在高性能DESynR转录因子中被优先利用。值得注意的是，许多高性能DESynR转录因子整合了来自在内源性T细胞中低表达的转录因子的结构域（如 JDP2 、 BATF2 、 MAFB 、 MAFA ），提示单个结构域中潜藏的功能潜能可通过结构域重组被解锁。

DESynR方法的通用性进一步在ETS和FOX两大转录因子家族中得到验证。在ETS家族中，研究团队从27个天然ETS转录因子中提取结构域，构建了14904种DESynR ETS转录因子。筛选结果显示， 753种DESynR ETS转录因子的促增殖能力超过了天然最优成员 ETV2 ，其中 SPIC-FEV-ETS1 、 FEV-FLI1-ETV6 等合成转录因子的表现尤为突出。结构域使用偏好分析揭示， ETS DNA结合结构域中的三个亚类（以 ETV2 、 ELF1 和 SPIC 为代表）被优先选用，而 SPDEF 亚类则被显著删除。在FOX家族中，研究团队人类50个FOX家族成员中选取各亚家族代表（含 FOXO 和 FOXP 全部成员），合成74个结构域，构建了约15000种DESynR FOX转录因子。筛选出1286种表现优于天然最优 FOX F1 的合成转录因子。引人注目的是，在129个显著富集的DESynR FOX转录因子中，有80个整合了 FOXR1 的N端结构域，而 FOXR1 是一个在T细胞中几乎不表达、功能尚未被充分表征的转录因子。这一发现在三个转录因子家族中反复出现，提示低表达结构域往往蕴含未被进化选择的功能潜能。

研究团队进一步对 AP1家族的 DESynR合成转录因子进行了系统性的功能验证。在涵盖不同共刺激信号（ CD19- CD28ζ vs. CD19- BBζ）、不同靶抗原与基底信号（ HA GD2 - CD28ζ）、不同受体类型（NY-ESO-1 TCR）、转录因子不同表达强度（TRAC内源启动子 vs. EF1α）以及不同 T细胞亚群（CD3 + 、 CD4 + 、 CD8 + ）的七项平行筛选模型中， DESynR转录因子在六项中位居顶级表现者，而 BATF3-BATF2-BATF3 是唯一在所有筛选中均显著富集的因子。在体内实验中，携带 JUN-FOS-BATF 的CD19-28ζ CAR-T细胞在亚治疗剂量的Nalm6白血病异种移植模型中显著延长了荷瘤小鼠的生存期。更关键的是，在治疗剂量联合两次肿瘤再挑战的模型中， JUN-FOS-BATF 组小鼠始终维持完全肿瘤控制，而对照组则丧失了肿瘤控制能力； JUN-FOS-BATF 组CAR-T细胞在脾脏、骨髓等组织中的持久性也显著优于对照，并在体外再挑战中保留了更强的肿瘤杀伤能力。在高度耗竭倾向的高亲和力GD2-28ζ CAR-T模型中， JUN-FOS-BATF 同样在低剂量下显著延长荷瘤小鼠生存期，在高剂量下优于天然FOS过表达和对照组，循环CAR-T细胞持久性平均为FOS过表达组的5.9倍。

为解析DESynR转录因子的作用机制，研究团队对表达五种DESynR AP-1转录因子、两种天然 AP-1转录因子（ BATF 、 JUNB ）或对照的慢性刺激CAR-T细胞进行了单细胞转录组测序（scRNA-seq）和ATAC-seq测序分析。无监督聚类识别出10个细胞亚群，按CD4/CD8谱系和增殖（ MKI67+ ）vs.细胞毒性（ PRF1+ ）表型进行注释，其中数个亚群为DESynR转录因子所特有。 MAFF-ATF3-BATF2 、 BATF3-JDP2-BATF2 和 JUN-FOS-BATF 驱动了最为显著的转录组和染色质可及性变化。对标志性T细胞基因模块的分析显示，除 BATF3-BATF2-MAFF 外的所有DESynR转录因子均下调了耗竭相关基因程序（ CTLA4 、 PDCD1 、 ENTPD1 、 TOX ）； MAFF-ATF3-BATF2 和 BATF3-JDP2-BATF2 （通过 IL7R 、 FOXO1 、 LEF1 ）以及 FOSL1-BATF-MAFA （通过 CCR7 、 SELL ）最具记忆/干性特征； JUN-FOS-BATF 则通过上调细胞毒性相关基因（ GZMB 、 PRF1 、 GNLY ）驱动效应功能。部分DESynR转录因子（如 MAFF-ATF3-BATF2 和 BATF3-JDP2-BATF2 ）不仅调控经典的T细胞功能基因模块，还激活了通常只在非免疫细胞中表达的基因程序，包括神经调节信号通路（ AREG 、 ITG A X ）、髓鞘形成信号通路（ ACVR2B 、 TCF7L 2）和平滑肌收缩相关通路（ GUCY1A1 、 ITGA1 ）。这些模块在对照CAR-T细胞中染色质均处于低可及性状态，而DESynR转录因子的表达则显著增加了这些区域的染色质可及性，提示合成转录因子能够解锁进化上被约束的表观遗传景观。

为进一步解答DESynR转录因子如何实现不同于天然转录因子的转录输出，研究团队通过ChIP-seq和RNA-seq ，比较了三种DESynR AP-1转录因子（ MAFF-ATF3-BATF2 、 FOSL1-BATF-MAFA 、 JUN-FOS-BATF ）、七种天然AP-1转录因子（各DESynR的亲本因子， MAFF因技术限制未纳入）以及阴性对照在急性刺激CAR-T细胞中的全基因组结合图谱。以 MAFF-ATF3-BATF2 及其三个亲本转录因子（ ATF3 、 MAFF 、 BATF2 ）为核心的分析显示，在4675个差异表达基因中， 82.3%被至少一个转录因子近端结合，而88%被三个或全部四个转录因子共同结合；相比之下，转录因子特异性结合仅见于6%的差异表达基因。这表明DESynR转录因子并非主要通过占据全新的基因组位点来实现功能增强，而是在与天然转录因子共享的、 T细胞特异性的顺式调控元件上实现了差异化的转录调控。例如，细胞毒性基因 GNLY 被 JUN-FOS-BATF 及其三个亲本因子共同结合，但只有 JUN-FOS-BATF 能够显著诱导其表达；记忆相关基因 CCR7 仅在 FOSL1-BATF-MAFA 表达时被显著激活；长期持久CAR-T细胞标志物 FXYD2 则被 MAFF-ATF3-BATF2 强力上调。扩展至全部十种转录因子的分析显示， 5050个差异表达基因中有761个（15.1%）被所有十种因子共同结合，涵盖效应、耗竭和记忆等标志性T细胞基因。基于这些数据，研究团队提出了一个调控模型，DESynR转录因子可能通过改变AP-1二聚体的组成与功能来重编程转录输出，JUN-FOS-BATF中的FOS bZIP结构域可能强制与JUN形成异源二聚体，并非天然地并置两个JUN反式激活结构域，从而在共享的染色质可及区域上实现不同于天然转录因子的调控效果。

综上所述，本研究从结构域重组的进化原理出发，建立了一套可扩展的合成转录因子发现DESynR平台，并从数万个非天然存在的转录因子中筛选出功能超越天然进化产物的候选分子。这一策略的核心启示在于，进化塑造了 “ 够用 ” 的蛋白质，但未必塑造了 “ 最优 ” 的蛋白质。通过系统性重组现有结构域，我们有可能绕过数亿年的进化约束，直接设计出针对特定治疗需求的最优基因。 DESynR平台的通用性已在AP-1 、 ETS和FOX三个转录因子家族中得到验证，未来可扩展至其他蛋白质家族、跨家族组合乃至与合成结构域的整合。从更广阔的视角来看，这项工作不仅为CAR-T疗法的优化提供了可直接转化的候选分子，更建立了一种 “ 功能驱动型 ” 的蛋白质工程范式，即将天然蛋白质视为可重新编排的 “ 功能模块乐高 ”，在人类细胞中直接筛选出超越自然进化的合成功能蛋白。