组蛋白 H3 第 79 位赖氨酸甲基化（H3K79me）是真核染色质中重要的表观遗传修饰，参与转录调控、DNA 损伤应答及细胞命运维持等多种生物学过程。Dot1L 是哺乳动物中唯一不含经典 SET 结构域、专门催化核小体 H3K79 甲基化的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，其功能异常与混合谱系白血病、结直肠癌、心脏功能障碍等多种疾病密切相关。值得注意的是，Dot1L 已是备受关注的表观遗传药物靶点：其小分子抑制剂 Pinometostat（EPZ-5676）已进入 Ib/II 期临床试验，用于 MLL 重排急性髓系白血病等。因此，深入解析 Dot1L 活性调控机制，对理解耐药、优化联合用药和开发新型抑制剂具有重要意义。
此前关于 Dot1L 活性调控的研究，多聚焦于核小体底物侧的组蛋白修饰。例如 H2BK120Ub可限制 Dot1L 在核小体上的取向并提高催化活性构象比例；H4K16ac可增强 Dot1L 与核小体的结合亲和力；H2BK34Ub则通过诱导核小体结构形变，增强 H3K79 催化位点的构象动态，从而激活 Dot1L。但相较于这些“底物端”调控，Dot1L 蛋白自身的翻译后修饰如何直接调控其核小体识别与催化活性，长期以来缺乏系统的机制解析；而均一位点特异性修饰蛋白的制备难题，是阻碍该方向研究的核心技术瓶颈。
近日，上海交通大学药学院艾华松课题组联合山东第一医科大学药学院李玉磊课题组，依托蛋白质化学半合成技术，建立了一套模块化的 Dot1L 催化结构域半合成策略，精准制备了携带不同磷酸化与乙酰化组合修饰的 Dot1L 蛋白，系统阐明了这些自身修饰对 Dot1L 核小体结合能力及 H3K79 甲基化活性的调控规律。相关成果以“Semi-Synthesis of Multiphosphorylated and Acetylated Histone Methyltransferase Dot1L Reveals Synergistic Inhibition of Nucleosomal H3K79 Methylation”为题发表于国际顶级化学期刊《Journal of the American Chemical Society》。
模块化半合成策略突破多位点修饰制备瓶颈
为解决多位点修饰Dot1L蛋白难以均一制备的问题，研究团队基于Dot1L催化结构域的结构特征开展了逆合成设计。晶体结构（PDB: 1NW3）显示，Dot1L(1–416) 包含结构稳定的 N 端催化核心（约 5–332 位残基）与柔性的 C 端富赖氨酸区域（LRR，333–416）。团队将其拆分为可通过大肠杆菌重组表达的 N 端片段 Dot1L(1–337)，以及适合化学合成的 C 端 LRR 片段 Dot1L(338–416)；通过 R335P/E337T/Q338G 三点突变，将两片段连接处的天然序列改造为 Sortase A 识别基序 LPETG，实现了两段蛋白的位点特异性化学酶促连接。
针对含 79 个残基、同时携带多个磷酸化与乙酰化位点的 LRR 片段，研究团队进一步将其拆分为 Dot1L(338–375) 与 Dot1L(376–416) 两个多肽片段，采用肽肼连接策略进行组装。团队创新性地优化建立了“微波辅助合成—手动温和偶联”相结合的固相多肽合成方案：在第一个磷酸化位点之前采用高效微波合成提升效率，从磷酸化残基开始则切换为条件更温和的手动双偶联与室温脱保护，显著降低了磷酸化氨基酸的 β-消除副反应，最终成功制备了全部多磷酸化及磷酸化/乙酰化双修饰肽段（图 1）。
图1. Dot1L多位点磷酸化/乙酰化蛋白的半合成策略
随后，研究团队通过肽肼连接将两个化学合成片段组装为完整的 Dot1L(338–416) LRR 区域，经自由基脱硫反应恢复 A376 天然位点，分别获得未修饰、五位点磷酸化（S351/T355/S374/S390/S392）、五位点乙酰化（K358/K387/K397/K398/K401）及五位点磷酸化/五位点乙酰化双修饰共 4 种 LRR 片段；再通过 Sortase A 介导的连接反应，将合成的 LRR 片段与重组表达的 Dot1L(1–337) 定点拼接，成功构建了 4 种化学组成均一的全长 Dot1L 催化结构域蛋白。Sortase A 连接在 30 分钟内转化效率超过 95%，产物经 HiTrap Heparin 离子交换色谱纯化，并经 RP-HPLC、ESI-MS、SDS-PAGE验证（图 2）。
图2. Sortase A介导的Dot1L(1-416)催化结构域半合成
磷酸化与乙酰化协同抑制 Dot1L 催化活性
基于上述化学组成明确的 4 种 Dot1L 蛋白，研究团队系统评估了不同翻译后修饰状态对 Dot1L 甲基转移酶活性的调控作用。研究分别以未修饰核小体和 H2BK120 单泛素化核小体为底物，通过荧光检测试剂盒定量检测甲基转移反应产物 S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）的生成速率，评价催化活性。结果显示：在 H2BK120 单泛素化核小体底物上，未修饰 Dot1L 催化活性最高；五位点磷酸化与五位点乙酰化分别使 Dot1L 活性较未修饰蛋白降低约 46% 和 43%，而同时携带两类修饰的双修饰 Dot1L 活性较未修饰蛋白进一步下降约 67%。在未修饰核小体底物上也观察到一致趋势，磷酸化、乙酰化及双修饰分别使活性较未修饰蛋白降低约 64%、61% 和 75%。上述结果表明，LRR 区域的磷酸化与乙酰化均可抑制 Dot1L 介导的 H3K79 甲基化，且两类修饰同时存在时产生显著的协同抑制效应（图 3）。
图3. Dot1L磷酸化与乙酰化协同抑制核小体H3K79甲基化活性
分子机制：修饰削弱静电相互作用，降低核小体结合亲和力
为进一步解析这种活性抑制的分子基础，研究团队采用电泳迁移率变动分析（EMSA）定量比较了不同修饰状态Dot1L与H2BK120Ub核小体的结合能力。结果显示未修饰Dot1L与核小体结合最强（Kd约为0.13 μM），五位点磷酸化和五位点乙酰化Dot1L的结合减弱（Kd分别约为0.30 μM和0.36 μM），而双修饰变体结合最弱（Kd约0.50 μM），较未修饰蛋白降低约4倍。结合团队此前冷冻电镜解析的Dot1L-H2BK34Ub-H3K79Nle核小体复合物结构（Nat. Chem. Biol.2022, 18, 972-980）中捕获到的一段延伸至核小体DNA双螺旋的额外Dot1L密度，提示富含正电荷赖氨酸和精氨酸的LRR区域能够与带负电荷的核小体DNA发生电荷相互作用。基于这一结构信息，研究推断：LRR区域的磷酸化会引入额外负电荷，而赖氨酸乙酰化则会中和其侧链正电荷，两类修饰均可削弱LRR与核小体DNA之间的静电作用；当磷酸化和乙酰化同时发生时，LRR整体电荷性质发生更显著改变，从而进一步削弱Dot1L对核小体的结合，并最终抑制H3K79甲基化活性（图3）。
研究意义
该工作融合化学蛋白质合成与表观遗传学研究，通过模块化蛋白半合成平台突破了位点特异性修饰Dot1L蛋白难以均一制备的关键技术瓶颈。与此前主要关注核小体底物端修饰激活 Dot1L 的研究不同，本工作将调控视角拓展至酶自身的翻译后修饰，提示 Dot1L 的催化活性可能受到“核小体底物修饰—酶自身修饰”双层面的协同精细调控。研究首次通过均一修饰蛋白样本阐明了 Dot1L 内在磷酸化与乙酰化对 H3K79 甲基化的协同抑制机制，不仅为理解内源性翻译后修饰依赖的 Dot1L 表观遗传调控提供了直接的分子证据，也为制备翻译后修饰定义的表观遗传酶类蛋白建立了一套通用的半合成技术体系，同时为后续靶向 Dot1L 的药物设计、活性调控机制解析提供了研究基础与干预思路。
本研究得到国家自然科学基金、山东省自然科学基金、上海市自然科学基金、泰山学者青年专家计划、山东省医药卫生科技项目、上海市抗体药物偶联物创新靶点重点实验室、上海药物靶点发现及递送前沿科学研究基地以及上海交通大学 2030 计划等项目资助。本论文的第一作者是上海交通大学药学院博士研究生辛美萱与山东第一医科大学药学院硕士研究生于龙杰，通讯作者是上海交通大学药学院长聘教轨副教授艾华松与山东第一医科大学药学院副教授李玉磊。
论文信息
Semisynthesis of Multiphosphorylated and Acetylated Histone Methyltransferase Dot1L Reveals Synergistic Inhibition of Nucleosomal H3K79 Methylation. Meixuan Xin#, Longjie Yu#, Xin Chen, Yun Liu, Danyu Chen, Akejiang Adeerjiang, Qi Shu, Yulei Li*, Huasong Ai*. J. Am. Chem. Soc., 2026, doi.org/10.1021/jacs.6c07839.
原文链接：https://pubs.acs.org/jacsat/article/doi/10.1021/jacs.6c07839
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