Science | 突破经典模型：PD-1抑制T细胞激活并不依赖磷酸化，揭示免疫检查点全新机制|t细胞|免疫检查点|受体|小分子抑制剂|磷酸化|蛋白|酪氨酸

撰文丨亦

在T细胞免疫学领域，T细胞受体（TCR）识别抗原后会迅速在细胞膜表面诱导形成高阶生物分子凝聚体（Biomolecular condensates，又称信号微簇 Signaling microclusters）。其中，活化T细胞接头蛋白（LAT）发生酪氨酸磷酸化（pLAT），通过多价相互作用招募GRB2和SOS1等接头蛋白，驱动 downstream 信号级联转导与T细胞全面活化。作为最关键的免疫检查点受体之一，程序性死亡受体1（PD-1）通过其胞质域中的免疫受体酪氨酸抑制 motifs（ITIM）和 switch motifs（ITSM）发挥负向调控作用。几十年来，领域内的经典工作模型一直认为：PD-1在配体结合后发生酪氨酸磷酸化，进而招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2来去磷酸化downstream靶分子，最终“熄灭”T细胞信号。然而，这一经典模型面临着重大科学难题与实验矛盾：遗传学敲除SHP1或SHP2并不能重现PD-1缺失的表型，也无法削弱PD-1阻断抗体在慢性感染或肿瘤治疗中的疗效；此外，LAG3和TIM3等部分抑制性受体根本不包含经典的ITIM/ITSM motifs。这表明免疫检查点必然存在某种独立于传统磷酸酶招募的全新信号抑制机制。

针对上述难题，美国 Genentech公司研究生物学部的Andrey S. Shaw团队在Science 上发表了题为 Unphosphorylated tyrosines mediate PD-1 inhibition of T cell signaling condensate formation 的研究论文。该研究结合细胞生物学、体外重构、单分子荧光成像及生物物理建模，成功破解了PD-1直接阻断T细胞信号凝聚体形成的根本机制。研究的核心结论颠覆了传统认知：PD-1对LAT凝聚体形成的抑制作用并不依赖于PD-1的酪氨酸磷酸化及磷酸酶招募，而是由其未磷酸化的内在无序胞质域（IDR）直接介导；通过供氢芳香族残基（酪氨酸/色氨酸）与酸性氨基酸序列语法的协同作用，PD-1能够直接扰动LAT凝聚体的组装，揭示了一种通用的免疫检查点非磷酸酶依赖性物理调控新范式。

一、细胞与体外重组证实：未磷酸化PD-1直接剂量依赖性阻断LAT凝聚体组装

研究人员首先在Jurkat T细胞与Raji B细胞组成的免疫突触模型以及抗体包被表面上证实，PD-1与配体PD-L1结合后能够显著抑制TCR诱导的LAT-mNeonGreen凝聚体形成、突触富集及细胞铺展。利用支持型脂质双分子层（SLB）进行体外生化重构实验，将生理密度范围（Resting LAT: 100–200 molecules/µm²; PD-1: 100–500 molecules/µm²）的pLAT与PD-1胞质域重组。结果发现，未磷酸化的PD-1胞质域（PD-1FL）能以剂量依赖方式极强地抑制pLAT-GRB2-SOS1凝聚体的形成。实时表面等离子体共振（SPR）分析进一步证实，当PD-1与pLAT的摩尔比例达到4:1以上时，能近乎完全阻断GRB2-SOS1复合物与pLAT的结合。荧光寿命成像-能量转移（FLIM-FRET）、FRAP及单分子荧光相关光谱（FCS）显示，PD-1使pLAT的侧向扩散时间延长了1.4至3.5倍（表观临界密度约700–800 mol/µm²），证明PD-1通过在膜平面上与pLAT发生直接物理相互作用，竞争性立体阻碍了GRB2 SH2结构域的招募。

二、范式转移：磷酸化消除抑制作用，色氨酸突变（Y-to-W）证实磷酸酶非依赖机制

与现有教科书模型截然相反的是，研究人员将PD-1的ITIM和ITSM基序进行体外双磷酸化修饰（PD-1phospho）后，发现酪氨酸磷酸化反而完全消除了PD-1对LAT凝聚体的抑制能力！当将这两个酪氨酸突变为苯丙氨酸（PD-1FF）时，抑制效应同样丧失。更决定性的突破来自于色氨酸突变体（PD-1mutW）：由于色氨酸（Trp）绝对无法被酪氨酸激酶磷酸化，也根本无法招募SHP1/SHP2等含SH2结构域的磷酸酶，但 PD-1mutW 突变体在体外重构、Jurkat T细胞及人原代T细胞中，均完全复现了野生型PD-1对LAT凝聚体形成、突触富集、pLAT流动性降低以及NFAT荧光素酶活化的强大抑制功能。

三、破译IDR“分子语法”：供氢芳香族残基与酸性电荷环境的协同调控

借助 NARDINI+ 算法对PD-1长的97个氨基酸内在无序区（IDR）进行序列语法分析，研究团队揭示了其独特的物理化学特征：PD-1胞质域富含芳香族残基，且包含显著的酸性氨基酸块（等电点 pI < 7）。突变实验表明，维持抑制功能需要满足两大物理化学规则：第一，必须具备能够提供氢键的芳香族残基——酪氨酸（Tyr）或色氨酸（Trp）均可提供氢键，而无法提供氢键的苯丙氨酸（Phe）或带负电的磷酸化酪氨酸则不具备此功能；第二，酸性局部电荷环境至关重要——若将胞质域中的酸性残基替换为碱性赖氨酸（PD-1mutK），其抑制LAT凝聚体及T细胞活化的能力彻底丧失。从物理机制上看，这一过程符合“多相联动（Polyphasic linkage）”模型：未磷酸化的PD-1在稀相中结合pLAT并遮蔽结合位点，从而重置了相变阈值，需要更高的pLAT浓度才能诱导凝聚体组装。

四、进化保守性：负向检查点的共性机制与LAG3的无Motif抑制

全蛋白质组序列语法分析表明，“酸性电荷背景+富含Tyr/Trp残基”是负向共刺激分子的共性特征，而正向共刺激分子（如CD28、ICOS、4-1BB）则倾向于碱性等电点且缺乏该特征。SPR和FCS实验证实，TIGIT、LAG3、TIM3 及 FcγRIIB 等抑制性受体的胞质域均能直接抑制pLAT凝聚体的组装。在 TIGIT 和 FcγRIIB 中将酪氨酸替换为色氨酸同样能维持完整的抑制活性。最令人印象深刻的是，完全缺乏经典酪氨酸 motifs、仅含有谷氨酸-脯氨酸（EP）重复序列的 LAG3 同样展现出强烈的LAT凝聚体抑制能力。这证明通过IDR介导的生物分子凝聚体扰动，是贯穿多种免疫检查点受体的通用生物物理机制。

综上所述，本研究通过系统的生化与细胞实验，证明了未磷酸化的PD-1能够通过其内在无序胞质域（IDR）中的供氢芳香族残基与酸性序列语法，直接与pLAT发生相互作用并竞争性阻断GRB2/SOS1组装，从而抑制TCR诱导的生物分子凝聚体形成与T细胞活化。这一过程完全独立于传统的酪氨酸磷酸化及SHP1/SHP2磷酸酶招募，为重新理解T细胞信号转导网络开辟了全新的生物物理学视角。