随着社会压力增加，亚健康状况日益普遍，人口老龄化加速，使认知能力下降和相关疾病成为全球公共卫生关注的主要问题。越来越多的流行病学证据表明，饮食补充不仅满足能量需求，而且与预防各种疾病和降低认知衰退的风险有关。此外，基于饮食营养补充的干预措施提供了固有的优势，如广泛的适用性和低的长期风险。近年来，食用菌被认为是富含蛋白质、多糖、酚类、三萜类和各种小分子代谢物的新型“超级食品”，越来越受到认知健康研究的关注。在此背景下，本研究旨在评价饮食中添加松茸活性成分对小鼠认知功能的影响，并寻找具有潜在增强记忆活性的可吸收小分子。
1.TP、TPS和TPT在小鼠体内的不良反应评价
如图1B所示，在灌胃期间监测了体重的变化。四组小鼠的平均体重均逐渐增加，组间无显著差异。小鼠的瘦肉、脂肪和水分的相对含量(图1C)显示没有显著差异。这些结果表明，灌胃TP、TPS和TPT对小鼠的生长发育没有不良影响，维持了小鼠的正常发育。
2.TP、TPS和TPT对小鼠行为的影响
行为学实验被有效地用于评估小鼠的空间学习和记忆能力。EAM是评估空间学习和记忆的经典模型。需要小鼠区分食物和空白手臂，避免重复输入，并缩短进入食物手臂的潜伏期，从而反映学习和记忆表现。图1D表明，接受TP、TPS和TPT处理的小鼠表现出更系统的行为，并有目的地接近食物手臂。具体地说，TP、TPS和TPT组的工作记忆和参考记忆错误率低于对照组。值得注意的是，TPT组的工作记忆错误率(9.93±3.59%)和参考记忆错误率(30.59±6.26%)均显著低于对照组(图1E，F)。此外，与对照组相比，TPS组和TPT组的潜伏期均显著缩短，其中TPT组的潜伏期最低(118.2±14.16 S)(图1G)。
3.TP、TPS和TPT对小鼠海马神经元的影响
尼氏染色是评价脑组织神经元结构的一种经典方法。CA1区负责记忆巩固，CA3区负责快速记忆存储，DG区负责防止记忆混淆。通过观察这三个区域的尼氏染色切片，可以直观地反映神经元细胞的完整性和尼氏小体的数量。在海马区的CA1、CA3和DG区，对照组和治疗组的神经元排列规则致密，没有明显的细胞萎缩迹象。与对照组相比，治疗组神经元染色更明显，尼氏小体在神经元层内分布更均匀；具有代表性的完整尼氏小体以黑色箭头表示(图2A)。
尼氏小体是成熟神经元的标志，促进蛋白质合成，是神经元活动的形态指标。尼氏小体水平在图2B中进一步量化，以确定尼氏计数。因此，TPT通过增加尼氏小体数量来改善神经元形态和增强活性，这与认知改善有关，可能是通过增加神经元蛋白质合成来实现的。
4.TP、TPS和TPT对小鼠胆碱能功能的影响
AChE和ACh是常用的用于评估学习和记忆能力的关键胆碱能生物标志物。胆碱能信号在学习和记忆过程中起着关键作用，AChE活性的降低可能有助于烟碱型和毒碱型乙酰胆碱受体的持续激活，从而提高突触效率和可塑性。如图2C所示，海马区ACh含量显著增加到9.21±0.44μg/mg prot，紧随其后的是TPS组，而TP组和对照组之间没有显著差异。从2D图看，与对照组(0.92±0.01U/mg prot)相比，各治疗组大鼠海马区AChE活性均显著降低；
在胆碱能系统中，神经递质的信号传递受AChE的调节，AChE可以分解突触间隙中的ACh，从而提高胆碱能终末的ACh水平，并密切影响学习和记忆。综合分析ACh和AChE的结果显示，灌胃TPT可显著增加ACh含量，降低AChE活性，从而增强小鼠的记忆和认知能力。
5.TP、TPS和TPT对小鼠海马区氧化应激水平的影响
如图2E−H所示，所有三个治疗组均表现出超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性增加，丙二醛水平降低。TPT可以改善小鼠海马区的氧化平衡，增强认知功能。先前的研究表明，氧化应激的增加在炎症的激活和组织损伤的发展中扮演着重要的角色。和厚朴酚是一种从厚朴中提取的化合物，据报道，它可以通过恢复超氧化物歧化酶水平，减少阿尔茨海默病小鼠海马区的丙二醛和ROS，维持线粒体自噬的动态平衡，从而缓解认知障碍。类似地，我们的结果表明，TPT降低了小鼠海马区的氧化应激，这可能是改善神经元功能和胆碱能活动，从而增强认知功能的基础。
6.TPT中记忆增强多肽的鉴定
在本研究中，小鼠灌胃给予TPT蛋白，2小时后收集肠液进行LC-MS/MS分析。其目的是确定TPT在消化过程中释放的可能有助于增强记忆的多肽。图3A，B显示了在小鼠肠液中检测到的多肽，这些多肽来自松茸的13种蛋白质。氨基酸组成分析表明，非极性氨基酸所占比例最大(57.61%)。45个不带电荷的极性氨基酸占25.84%，主要是丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸，它们增强了蛋白质的结构灵活性和生物活性。
序列标志(图3C)显示了氨基酸在不同长度的多肽上的分布，其中字母大小反映了出现频率。以前的研究表明，大多数受体蛋白都有疏水结合口袋。富含非极性残基的多肽更有可能跨膜并与疏水受体结合，表明疏水性与结合活性呈正相关。因此，本研究鉴定的短肽可能由于其高疏水残基含量和非极性氨基酸的末端浓缩而显示出强大的生物活性潜力。
7.模拟消化−吸收验证三七总皂苷记忆增强多肽的转运和利用
如图4A所示，TPT在体外进行模拟胃肠消化和肠道吸收。用LC-MS/MS分析模型两侧的多肽序列。共检测到TPT吸收前的2428个肽(TPT-BA)和吸收后的TPT中的224个肽(TPT-AA)。其中TPT-BA和TPT-AA共有168个多肽，表明这些多肽可以完全通过肠道屏障，消化后进入血液进行全身利用。
众所周知，氧化应激导致细胞功能障碍，在神经系统内，氧化应激是胆碱能神经元损伤的主要因素。氧化应激已被证明上调AChE活性，导致ACh水平下降和随后的胆碱能功能障碍。反过来，异常的AChE活性可能会进一步加剧胆碱能失衡和神经元损伤，从而形成恶性循环。通过分子对接获得了这五种多肽与AChE的结合模式。它们的3D和2D交互作用轮廓如图4B−F所示。然而，DFL只与AChE催化部位的三个残基相互作用，这与其较低的对接分数和较弱的结合稳定性一致。综上所述，PFL、LFL和AFL似乎是更有前途的AChE抑制剂，具有潜在的记忆保护作用。
结论
综上所述，本研究系统地阐明了每日补充松茸及其主要活性成分的认知增强作用，并确定了与这些作用相关的关键可吸收小分子。结果表明，TPT能显著提高小鼠的记忆成绩和海马区功能。同时，由于TPT具有调节海马胆碱能系统和减轻氧化应激的双重能力，因此被选为进一步研究的重点。松茸对小鼠的认知功能有明显的改善作用，其消化释放的多肽、LFL和AFL可能在记忆增强机制中起关键作用。膳食补充TPT可能为预防MCI提供了一种有前途的营养策略，而PFL、LFL和AFL则有可能成为开发针对MCI预防的功能性补充剂的先导分子。
在该研究中，研究人员使用了赛昂斯避暗穿梭测试仪（Sansbio，SA222）来进行实验操作。
作者提示: 个人观点，仅供参考
SA222 避暗穿梭测试仪
人类和动物的心理内部活动过程是无法直接观察到的，科学家只能根据可观察到的刺激反应来推测脑内发生的过程，对脑内记忆过程的研究也只能通过人类或动物学习或执行某项任务后，间隔一定时间，测量他们的操作成绩或反应时间来衡量这些过程的编码形式、贮存量、保持时间以及它们所依赖的条件等等。学习记忆实验方法的基础是条件反射，各种各样的方法均由此衍化而来，穿梭避暗实验就是其中的一种较常用的方法。该方法的优点是简便易行，既可观察药物对记忆过程的影响，也可观察对学习成绩的影响，有较高的敏感性，尤适合于药物初筛。
穿梭箱实验与避暗实验都是进行条件性记忆的常用实验方法。穿梭箱实验主要是通过声光电建立的条件反射，使动物进行主动回避；避暗实验则是通过电刺激使动物进行被动回避。
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