1 State Key Laboratory of Breeding Biotechnology and Sustainable Aquaculture, Hubei Hongshan Laboratory, The Innovation Academy of Seed Design, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China
2 College of Advanced Agricultural Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, China
3 Faculty of Biological Sciences, Fisheries and Aquaculture Lab, Department of Zoology, Quaid-i-Azam University, Islamabad, Pakistan
4 School of Life Science, Bengbu Medical University, Bengbu, Anhui, China
5 School of Marine Biology and Fisheries, Hainan University, Haikou, Hainan, China
Correspondence:
Zhen Xu (zhenxu@ihb.ac.cn)
Xiao-Qin Xia (xqxia@ihb.ac.cn)
VP1、VP35、VP41、VP38、VP56各蛋白序列及所有毒株未聚类的系统发育树分析结果
摘要
随着全球人口持续增长，水产养殖业已然成为增速迅猛的优质蛋白质供给来源。草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国的核心养殖鱼类之一，如今也逐步发展为全球范围内极具经济价值的养殖鱼种。然而，草鱼呼肠孤病毒（GCRV）给草鱼养殖产业构成了严峻威胁。为此，本文综述了草鱼呼肠孤病毒的生物学特性、系统进化规律、致病机制、机体免疫应答通路、防治手段，以及该领域现存挑战与未来研究方向。首先，本文阐释了GCRV的结构特征、细胞入侵方式、分子构型、复制周期，及其与宿主之间的相互作用，着重阐述了模式识别受体（PRRs）发挥的关键调控作用，并通过全面的系统进化分析首次发现了VP1序列的类间不保守性。接着，本文详细探究视黄酸诱导基因样受体（RLRs，包含 RIG-I、MDA5）、Toll 样受体（TLRs，包含 TLR3、TLR19）等PRRs如何特异性识别GCRV，进而启动强效的抗病毒免疫应答，尤其是干扰素通路。文章进一步剖析了GCRV复杂的免疫逃逸机制，如VP41、VP4、VP56 等病毒蛋白如何靶向并干扰MAVS–TBK1及MITA/STING信号轴中的关键分子，进而削弱宿主自身抗病毒免疫力。现阶段多款新一代疫苗正处于研发阶段，包括DNA疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒（VLP）疫苗以及口服/黏膜疫苗；同时中草药制剂与化学抗病毒药物也可作为辅助防疫手段。借助 CRISPR/Cas9 基因编辑技术与RNA干扰（RNAi）,已有研究证实，编辑宿主基因pi4kb和socs3a/3b能够提升草鱼对GCRV的抵抗力。综上所述，本研究为深入理解病毒入侵宿主细胞的机制提供了重要理论依据，同时丰富了鱼类天然免疫与适应性免疫的调控理论，为水产养殖业构建安全、高效、多层次的综合防控体系提供理论支撑。
关键词
未来研究 ， 草鱼呼肠孤病毒基因组 ， 宿主免疫系统 ， 系统发育 ， 干预策略
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Abstract
As the world's population grows, aquaculture is becoming a rapidly growing source of protein. Grass carp (Ctenopharyngodon idella) is one of the most important aquacultured species in China and has emerged as a significant commercial fish worldwide. However, grass carp reovirus (GCRV) poses a significant threat to grass carp aquaculture. This review covers GCRV biology, phylogeny, pathogenesis, immune response pathways, therapeutic approaches, and future challenges and directions. A comprehensive phylogenetic analysis describes the structure of GCRV, its entry into cells, its molecular architecture, its replication procedures and its interactions with the host, with a particular focus on the pivotal role of Pattern Recognition Receptors (PRRs). The paper explores how PRRs, such as RLRs (RIG- I and MDA5) and TLRs (TLR3 and TLR19), are essential for identifying GCRV and initiating robust antiviral responses, particularly the interferon pathway. The paper goes on to explain the complex immune evasion tactics employed by GCRV, emphasizing how viral proteins such as VP41, VP4 and VP56 selectively target and interfere with critical components of PRR signaling cascades, such as MAVS- TBK1 and MITA/STING, thereby reducing host immunity. Various next- generation vaccines are being developed, including DNA, subunit, VLP and oral/mucosal platforms. These are supported by Chinese herbal and chemical antivirals. According to CRISPR/Cas9, experimental RNAi, PI4KB and SOCS3a/3b are host genes that can be altered to increase grass carp resistance to GCRV. This research offers significant insights into viral cell invasion and strengthens innate and adaptive immunity, enabling safer, more practical and multilayered control in aquaculture.
Keywords
future research, GCRV genome, host- immune system, immunization, phylogenetic, therapeutic approaches
作者评述
1.引言
草鱼出血病的研究基本上贯穿了建国以来中国科学院水生生物研究所的历史，作为该所的研究人员，我们长期致力于GCRV的基础研究和防治技术开发。这篇综述正是我们团队对国内外在GCRV领域数十年研究积累的系统梳理。我们撰写该综述的初衷有三：其一，为国内外同行提供一个关于GCRV的全面知识框架；其二，总结我们在病毒入侵机制、宿主免疫应答和疫苗研发等方面的最新发现；其三，指出当前研究的不足和未来方向，以推动该领域向更深层次发展。接下来，我们将简要介绍该文的主要内容，并且就通过全面的系统进化分析首次发现VP1序列的类间不保守性的意义进行解读。
2.GCRV是“何方神圣”？
草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国淡水养殖鱼类中的支柱品种，占比高达21.69%（2024年）。然而，由草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus, GCRV）引起的草鱼出血病，死亡率可高达80%，年经济损失达10亿元，给无数养殖户带来生计之痛，也是我国水产养殖业面临的重大挑战。
GCRV的发现史本身就是一部中国鱼类病毒学研究的缩影。早在20世纪50年代，中国科学院水生生物研究所的研究人员就观察到病鱼的组织充血现象。但由于当时条件所限，直到1974年才初步确定病原为病毒，1984年正式确认为呼肠孤病毒，是我国发现的第一种鱼类病毒。迄今为止，国内外已报道超过60株GCRV毒株，主要分布在亚洲地区。GCRV可分为三个主要基因型：I型、II型和III型，其中GCRV-II型危害最为严重，是目前的主要流行株，也是我们疫苗研发的重点靶标。
3.病毒入侵的“精准打击”：入胞与系统传播
GCRV如何进入宿主细胞，是我们理解其致病机制的关键。通过多年研究，一条清晰的入侵路径逐步被揭示出来：
（1）初始附着：GCRV的外衣壳蛋白首先与宿主细胞表面的唾液酸（Sialic Acid） 修饰的糖复合物结合，将病毒颗粒“锚定”在细胞表面。这一发现为我们理解病毒的宿主嗜性提供了重要线索。
（2）受体介导的内吞：随后，病毒通过与多种蛋白受体（包括Hsp90、SR-BI等）的相互作用，启动网格蛋白依赖的、动力蛋白依赖的、pH依赖的内吞途径。Hsp90不仅作为受体介导病毒结合，还通过与网格蛋白的物理相互作用，将病毒“护送”入胞。
（3）胞内转运与复制：病毒在内吞体中被运送至溶酶体，在酸性环境下完成脱衣壳，释放具有转录活性的核心颗粒进入细胞质，随后在被称为“病毒工厂”的胞质包涵体中完成基因组复制和子代病毒组装。
（4）系统传播：病毒可通过"鼻孔-嗅球-脑轴"、鳃和皮肤快速入侵，并在单核/巨噬细胞中复制，诱导M1/M2极化和凋亡，从而“劫持”免疫细胞实现系统性扩散。值得一提的是，脑组织更是其长期潜伏的"病毒库"，具有温度依赖性复活特征。
4.宿主免疫的“攻防战”：PRR识别与病毒反制
草鱼如何识别GCRV并启动抗病毒免疫？研究表明，模式识别受体（PRRs）在此过程中发挥核心作用。在识别层面，RLRs（RIG-I和MDA5）和TLRs（TLR3、TLR19等）是感知GCRV的关键传感器。RIG-I和MDA5识别病毒dsRNA，通过MAVS-TBK1-IRF3/7轴诱导I型干扰素，MDA5能诱导比RIG-I更强的I型干扰素应答。此外，补体系统也参与其中，CFI（补体因子I）作为负调控因子维持补体稳态。然而，GCRV并非“坐以待毙”。病毒进化出了一套精密的免疫逃逸武器库：
（l）VP4：一方面促进RIG-I的K48泛素化降解，另一方面劫持自噬受体TOLLIP介导STING的降解；
（2）VP35：通过宿主自噬途径靶向适配器MAVS降解，从而阻碍IFN诱导；
（3）VP56：与VP4协同作用，进一步削弱干扰素信号；
（4）NS80：通过液-液相分离形成无膜细胞器——病毒质，既浓缩病毒组分以促进复制，又“扣押”宿主抗病毒分子以实现免疫逃逸。
GCRV的“全方位压制”策略解释了它为何具有如此高的致死率。同时，这种"宿主-病原"互作的精细调控，凸显了草鱼出血病防控的复杂性，也说明任何单一靶点的干预都可能面临病毒的反制。
5.防治策略现状与展望：从疫苗到抗病育种
疫苗是防控GCRV最有效的手段。针对GCRV-II的灭活疫苗，注射免疫后相对保护率高达80%。此外，DNA疫苗、亚单位疫苗和病毒样颗粒（VLP）疫苗等新型疫苗平台也展现出良好前景。中草药与天然化合物方面，绿茶中的主要儿茶素EGCG能在体内外有效抑制GCRV，兼具抗病毒和免疫保护双重功能。arctigenin和andrographolide等天然产物也展现出剂量依赖性的抗病毒活性。
抗病育种为对抗GCRV提供了良好前景。目前已经鉴定了多个与GCRV抗性相关的单核苷酸多态性（SNP） 标记，涉及TLR3、TLR8、TLR22、MDA5、RIG-I等多个免疫基因，这些标记为标记辅助选择（MAS） 育种提供了重要工具，我们团队在这方面已经取得了重要进展。此外，一些抗病相关基因的鉴定也为基因编辑育种提供了可行性。siRNA/shRNA在实验室中可特异性沉默病毒基因，但受限于递送系统、脱靶效应和成本，短期内难以产业化。相比之下，CRISPR/Cas9基因编辑展现出更大潜力，利用CRISPR/Cas9技术敲除了SOCS3a/3b和PI4KB等宿主基因，显著增强了草鱼对GCRV的抗性，证实了基因编辑育种的潜力。
展望未来，我们认为以下方向值得重点关注：（1）不同GCRV基因型之间的交叉保护问题亟待解决。当前疫苗主要针对GCRV-II型，对I型和III型的保护效果尚需评估。（2）口服和浸泡疫苗的研发是规模化免疫的关键。尽管已有多种尝试，但如何在保持免疫原性的同时实现便捷给药，仍是重大挑战。（3）多组学整合分析将帮助我们更全面地理解病毒-宿主互作，为精准防控提供新思路。（4）基因编辑抗病育种虽然前景光明，但面临技术成熟度、法规审批和公众接受度等多重障碍，需要持续推进。
6.VP1不保守性的意义
在RNA病毒中，RdRp（VP1）通常是全基因组中最保守的蛋白之一，因其承担基本的转录和复制功能，受强烈的功能选择压力约束。然而在本综述中我们通过系统进化分析却揭示：GCRV-I型（873株）的VP1与II型、III型以及AGCRV的VP1序列相似性极低，且在氨基酸水平上具有大量独有变异（见图1B红框标记区域），整体上显现为跨基因型不保守+基因型内保守（见图1A）的双重特征。该特征颠覆了“聚合酶必保守”的默认假设，提示GCRV的三种基因型在RNA合成机制上可能存在不同的酶学动力学特征，例如转录效率、模板结合亲和力或对宿主因子的依赖性不同。VP1的不保守性形成机制尚无明确解释，推测源于进化历史上与其它水生呼肠病毒的基因组片段重组和宿主适应性选择，
这一发现具有多方面的意义。首先，它为GCRV的基因型划分提供了分子分类依据，也为后续研究不同基因型致病性差异（GCRV-II高致死率 vs. GCRV-III弱毒株104）提供了一个全新的分子靶标。其次，对诊断靶标设计也提出了挑战和警示，因为当前基于RT-PCR或LAMP的GCRV分子检测方法，大多选取保守区域设计引物/探针，那么未来诊断试剂的研发必须避开VP1的非保守区域，或采取多靶标联合检测策略。同时，这也意味着今后通用型抗GCRV药物与疫苗设计需要有“基因型特异性”方面的考量。
图1. 不同GCRV毒株保守与可变蛋白序列的比较分析。（A）热图展示了10株不同GCRV毒株的蛋白表达情况。10个毒株中有6个直系同源簇（VP2、VP3、VP4、VP5、VP6和NS1）均包含全部10个蛋白，表明这些蛋白在所有GCRV毒株中高度保守且具有重要的功能意义。（B）代表性GCRV毒株VP1蛋白的多序列比对。残基比对结果显示了多个位点的变异（红色高亮标记），表明所选毒株之间缺乏保守性。
7.结语
GCRV与草鱼的"博弈"是一场持续半个多世纪的"猫鼠游戏"。这篇综述不仅是对过往研究的系统总结，更是对未来方向的展望。我们认为，未来的GCRV防控必须走"多管齐下、整合创新"之路：以分子设计疫苗和黏膜免疫为核心防线，以中草药和免疫增强剂为辅助屏障，以分子标记和基因编辑育种为根本解决之道，以快速诊断和生物安全为监控网络。我们期待这篇综述能为中国乃至全球草鱼养殖业的绿色、可持续发展提供理论支撑和技术参考。欢迎同行批评指正，也期待与各位开展深入合作！
作者简介
徐镇（通讯作者）：中国科学院水生生物研究所研究员，博士生导师，担任水产品种创制与高效养殖全国重点实验室主任及中国水产学会鱼病专业委员会副主任委员， 2023 年获国家自然科学基金委杰出青年基金资助。团队长期聚焦鱼类抗病免疫与遗传育种领域，系统解析病原入侵感染及鱼类抗病性状的分子调控机制，成果发表于 Science Immunology 、 Cell Discovery 、 PNAS 等国际权威期刊，主持国家科技创新 2030-农业生物育种重大项目课题，中国科学院先导B专项，国家重点研发计划课题和多项国家基金项目等项目。
夏晓勤（通讯作者）：中国科学院水生生物研究所研究员，博士生导师。团队致力于解析鱼类生长、性别、抗病等重要经济性状的分子基础，综合运用基因编辑、雌核发育、基因组选择等技术培育优良品种。解析了大量鱼类经济性状关联基因；建立了鱼药快速研发的斑马鱼模型，挖掘了一系列替抗中草药。此外，还建立了一系列鱼类分子信息数据库与数据处理平台，开发了鱼类快速选育成套新技术，包括大规模亲子鉴定、高通量基因型鉴定、AI赋能表型采集、低成本GWAS分析和精准基因组组装等。
Waqar Younas（并列第一作者）：来自巴基斯坦的博士研究生，就读于中国科学院大学，师从夏晓勤研究员，研究方向为水生动物病毒与宿主互作机制。他聚焦于胆固醇代谢通路在GCRV等多种水生病毒复制中的广谱调控作用，证实7-脱氢胆固醇还原酶（dhcr7）和3β-羟基类固醇-Δ24还原酶（dhcr24）是多种水生病毒依赖的保守宿主靶点，揭示了病毒感染早期胆固醇代谢调控、细胞周期进程与天然免疫应答之间的动态关联机制。相关成果为水产养殖广谱抗病毒策略的开发提供了重要理论依据。
石米娟（并列第一作者），中国科学院水生生物研究所副研究员，硕士生导师。长期从事水产智慧育种研究，研究方向涵盖水产领域的组学数据库构建、选育算法与工具开发，以及基于AI的表型检测技术研发。相关成果发表于《Science China Life Sciences》《International Journal of Biological Macromolecules》《Aquaculture》等期刊，共计30余篇。主持国家自然科学基金青年项目及面上项目，并参与多项国家级和省部级重点研发计划。
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