Pharmacol Research (IF12.2）：揭示单体山茶苷A靶向SIRT3激活FOXO3-PINK1轴抗光老化机制

【写在前面】：本期推荐的是由林清轩&上海交通大学抗细胞衰老联合研究实验室、江苏省中药功能物质重点实验室等研究团队合作近期发表于Pharmacological Research(IF12.2）的一篇文章，揭示山茶苷A（Camellioside A）靶向SIRT3促进FOXO3-PINK1/parkin依赖的线粒体自噬，并减轻UVB诱导的皮肤光老化。

【期刊简介】

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【题目及作者信息】

Camellioside A engages SIRT3 to promote FOXO3-PINK1/parkin dependent mitophagy and attenuate UVB-induced skin photoaging

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研究背景：

皮肤光老化主要由慢性紫外线（UV）照射驱动，临床表现为皱纹、弹性丧失、红斑、干燥及色素沉着。在细胞层面，UVB反复损伤线粒体，导致膜电位下降、呼吸功能受损，进而诱发成纤维细胞衰老和细胞外基质（ECM）降解——I型胶原合成减少，而MMP-3、MMP-9等基质降解酶表达上调。成纤维细胞是ECM合成与周转的核心细胞，其线粒体功能障碍被认为是驱动光老化进程的关键枢纽。

浙江红花油茶的花在临床和化妆品应用中显示出抗衰老与皮肤焕活潜力，但其药效物质基础及分子机制长期不明确，严重制约了以其为来源的抗光老化产品的机制导向开发与质量控制。基于此，研究者建立了UVB诱导的人成纤维细胞表型筛选平台，从浙江红花油茶中锁定山茶苷A（CA）为关键保护成分，并围绕线粒体质量控制深入解析其作用机制。

研究目的：

以浙江红花油茶为对象，锁定山茶苷A为关键抗光老化成分，并系统阐明其直接靶向SIRT3、激活FOXO3-PINK1/Parkin线粒体自噬轴以改善UVB诱导皮肤光老化的分子机制。

研究方法：

1. 表型筛选与细胞模型：从浙江红花油茶中选取17个已分离天然产物，在UVB应激的人包皮成纤维细胞（HFFs）和NIH-3T3细胞中进行CCK-8筛选；以SA-β-gal染色、qPCR和免疫印迹评价衰老及ECM相关标志物。

2. 线粒体功能与自噬评估：采用Seahorse XF96细胞外通量分析检测氧消耗率（OCR）；JC-1染色检测膜电位；透射电镜观察线粒体超微结构及线粒体自噬体；免疫荧光和免疫印迹评估LC3B-II/p62通量及PINK1/Parkin的线粒体募集。

3. 靶点鉴定与结合验证：通过CETSA、SIP、SPR确认CA与SIRT3的直接结合；结合分子对接和分子动力学模拟预测结合位点，并通过SIRT3-Q228A定点突变进行功能验证。

4. 机制解析：利用CUT&Tag-qPCR定位FOXO3在PINK1启动子上的结合区域，双荧光素酶报告基因验证功能性响应元件；免疫印迹检测FOXO3 K271位点乙酰化及核转位。

5. 体内验证：建立慢性UVB诱导小鼠光老化模型，局部外用CA软膏；通过AAV9介导的Sirt3敲低在体验证SIRT3的因果贡献。

研究结果：

1. 山茶苷A是浙江红花油茶抗光老化的关键活性成分

在17个候选化合物中，CA在UVB应激的HFFs和NIH-3T3细胞中均表现出最强的细胞活力保护作用。CA显著减少SA-β-gal阳性衰老细胞比例，降低TNF、IL1B、IL6等衰老相关炎症因子mRNA表达；同时逆转UVB诱导的衰老与ECM标志物异常——CDKN1A、TP53下降，COL1A1回升，MMP1/3/9受到抑制，蛋白水平结果与之一致。

2. 局部外用CA显著改善小鼠慢性光老化表型

在慢性UVB小鼠模型中，CA软膏减轻了皮肤粗糙、红斑和皱纹，缩短皮肤捏起恢复时间，提升皮肤水合度和羟脯氨酸含量；HE染色显示表皮增厚得到缓解。EVG和Masson染色进一步证实，CA保护了弹性纤维连续性、减少了胶原丢失、维持了真皮基质结构有序性，并恢复了SOD、GSH-Px活性、降低了MDA水平，同时抑制了Il6、Il1b、Tnf等炎症基因表达。

3. CA恢复线粒体氧化还原稳态并改善线粒体质量控制

UVB导致细胞内ROS显著累积、线粒体肿胀和嵴结构破坏，CA处理显著逆转了这些异常。CA恢复了UVB下降的NAD⁺水平，改善JC-1红/绿荧光比值，并部分恢复OCR相关参数（基础呼吸、ATP偶联呼吸、最大呼吸能力）。透射电镜进一步显示，CA增加了包裹受损线粒体的线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体数量，LC3B-II/LC3B-I比值升高、p62下降，LC3B与线粒体、LAMP1与线粒体的共定位增强。CA还促进了PINK1和Parkin向线粒体的募集，并加速了线粒体外膜蛋白VDAC1的周转；氯喹阻断溶酶体后，CA对VDAC1的降解作用被取消，证实其依赖完整的自噬-溶酶体通路。

4. SIRT3是CA发挥线粒体保护与抗光老化作用的直接靶点

生物信息学分析与实验验证共同指向SIRT3：UVB显著降低SIRT3蛋白水平，而CA浓度依赖性恢复其表达并增强去乙酰化酶活性。CETSA显示CA使SIRT3热稳定性右移约3°C，SIP和SPR确认二者直接结合，解离常数K_D = 6.572 μM。分子对接和动力学模拟预测CA结合于SIRT3催化结构域的口袋，Gln228等残基贡献关键结合能；SIRT3-Q228A突变显著削弱CA诱导的热稳定化和酶活性激活，并取消CA对衰老标志物（CDKN1A、TP53）和ECM相关基因（COL1A1、MMP3、MMP9）的调控作用。siRNA敲低SIRT3同样废除了CA对PINK1/Parkin线粒体募集和自噬通量的促进作用。

5. SIRT3-FOXO3-PINK1轴串联线粒体去乙酰化与线粒体自噬转录程序

在机制下游，CA促进FOXO3在K271位点去乙酰化，并驱动其核转位；SIRT3-Q228A突变或SIRT3敲低均削弱这一效应。FOXO3-K271R（乙酰化缺陷突变体）进一步证实K271去乙酰化对CA诱导的FOXO3核积累至关重要。CUT&Tag-qPCR将FOXO3在PINK1启动子上的结合区域定位至−800至−301 bp，双荧光素酶报告基因锁定其中−550至−546 bp的AAACA序列为功能性FOXO3响应元件；该序列突变后，CA对PINK1启动子的激活作用消失。由此形成一条清晰的信号轴：CA → SIRT3激活 → FOXO3 K271去乙酰化/核转位 → PINK1转录增强 → PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬。

6. 体内AAV9介导Sirt3敲低验证CA抗光老化效应的SIRT3依赖性

在慢性UVB小鼠模型中，局部CA显著改善皱纹、表皮增厚和真皮胶原/弹性纤维结构，而AAV9介导的背部皮肤Sirt3敲低大幅削弱了这些保护效应。在Sirt3敲低背景下，CA对Col1a1的恢复作用和对Mmp3、Mmp9的抑制作用被显著削弱，FOXO3核转位受阻，PINK1蛋白水平下降，LC3B-II/p62自噬通量指标同步恶化，从体内因果层面确认了SIRT3-FOXO3-PINK1轴在CA抗光老化效应中的核心地位。

研究结论：

本研究将山茶苷A鉴定为浙江红花油茶抗光老化的关键活性成分，并阐明其作用依赖于一条此前未被充分认识的SIRT3-FOXO3-PINK1信号轴。CA通过Gln228依赖的方式直接结合并激活线粒体去乙酰化酶SIRT3，促使FOXO3在K271位点去乙酰化并转位入核，进而转录激活PINK1，启动PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬，清除受损线粒体、恢复线粒体稳态，最终减轻成纤维细胞衰老和ECM降解，改善UVB诱导的皮肤光老化。

研究亮点：

从“花”到“分子”：在浙江红花油茶的花中锁定山茶苷A为关键抗光老化成分，为这一传统护肤植物资源提供了明确的药效物质基础。

直接靶点明确：CETSA、SIP、SPR三重证据确认CA与SIRT3的直接结合，并首次将Gln228定义为CA-SIRT3相互作用的关键残基。

机制链路完整：串联“线粒体去乙酰化酶（SIRT3）—转录因子（FOXO3）—线粒体自噬受体（PINK1）”，将线粒体应激感知与受损线粒体选择性清除在光老化背景下统一起来。

体内因果验证：AAV9介导的Sirt3敲低在动物水平反向验证了靶点依赖性，增强了机制结论的体内外一致性。

转化指向清晰：CA局部外用即显示出明确的抗光老化表型改善，为基于浙江红花油茶活性成分的皮肤抗衰产品开发提供了可操作的分子靶标与候选化合物。

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Graphical abstract

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Fig.1｜CA显著减轻UVB诱导的成纤维细胞光老化。（A）HFFs经UVB（200 mJ/cm²，6 min）后给予17个候选化合物（10 μM，24 h），CCK-8检测细胞活力，筛选出CA。（B–C）CA（0.1、1、10 μM）降低SA-β-gal阳性衰老细胞比例。（D–L）qPCR检测TNF、IL1B、IL6、CDKN1A、TP53、COL1A1、MMP1、MMP3、MMP9表达。（M–Q）免疫印迹检测MMP3、MMP9、p53、p21蛋白水平。整体显示CA抑制衰老和ECM降解。

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Fig.2｜CA改善小鼠慢性UVB光老化及真皮重塑。（A–E）小鼠背部皮肤外观及红斑强度、皱纹评分、皮肤捏起恢复时间、皮肤水合度、羟脯氨酸含量定量。（F–G）HE染色及表皮厚度定量，显示CA缓解表皮增生。（H）EVG和Masson染色评估弹性纤维和胶原沉积。（I–K）qPCR检测Col1a1、Mmp1、Mmp3。（L–N）检测SOD、GSH-Px活性和MDA含量。（O–Q）qPCR检测Il6、Il1b、Tnf。显示CA保护真皮基质并减轻氧化/炎症损伤。

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Fig.3｜CA恢复UVB诱导光老化中的线粒体稳态。HFFs经UVB后给予CA（0.1、1、10 μM，24 h）。（A–B）免疫荧光检测细胞内ROS（scale bar = 200 μm）。（C）透射电镜观察线粒体超微结构。（D）商业试剂盒检测NAD⁺含量。（E–F）JC-1染色检测线粒体膜电位及红/绿荧光比值（scale bar = 50 μm）。（G）Seahorse细胞外通量分析OCR曲线。（H–K）计算非线粒体呼吸、基础呼吸、ATP偶联呼吸和最大呼吸能力。显示CA改善线粒体氧化还原和呼吸功能。

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Fig.4｜CA促进线粒体自噬以维持线粒体稳态。（A）透射电镜观察线粒体形态和自噬泡，红箭头指示自噬泡。（B–D）免疫印迹检测LC3B-I/II和p62。（E–F）免疫荧光检测MitoTracker与LC3B、LAMP1共定位（scale bar = 20 μm）。（G–H）检测MitoTracker与PINK1、Parkin共定位（scale bar = 50 μm）。（I–K）免疫印迹检测线粒体组分中PINK1、Parkin及VDAC1。（L–M）CHX处理下检测VDAC1降解，评价线粒体蛋白周转。（N–Q）CQ阻断溶酶体后检测LC3B-II、p62、VDAC1，评估自噬/线粒体自噬通量。（R–V）PINK1敲低后检测CDKN1A、TP53、COL1A1、MMP1、MMP3、MMP9，验证PINK1依赖性。整体表明CA增强PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。

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Fig.5｜SIRT3是CA促线粒体自噬和抗光老化所必需。（A）公共数据集GSE240226中UVB照射后SIRT3、SIRT4、SIRT5表达变化，SIRT3下降最明显。（B–D）CA恢复UVB下调的SIRT3蛋白，并增强SIRT3去乙酰化酶活性；Honokiol和2-APQC作为阳性对照。（E–G）si-Sirt3后检测ROS和ATP，CA的抗氧化和ATP恢复作用被削弱。（H–J）si-Sirt3后检测LC3B-II和p62，CA促自噬通量作用减弱。（K–M）si-Sirt3后检测线粒体PINK1、Parkin，CA促募集作用减弱。（N–T）si-Sirt3后SA-β-gal染色及CDKN1A、TP53、COL1A1、MMP3、MMP9检测，CA抗衰老和ECM调控作用被削弱。说明SIRT3位于PINK1/Parkin线粒体自噬上游。

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Fig.6｜Gln228介导CA-SIRT3结合及抗光老化活性。（A–B）CETSA检测CA处理后SIRT3热稳定性，熔解温度右移约3°C。（C–D）SIP实验检测CA对SIRT3溶剂诱导沉淀的抵抗。（E）SPR检测CA与重组SIRT3直接结合，K_D = 6.572 μM。（F）分子对接预测CA结合SIRT3催化结构域口袋。（G–H）分子动力学模拟的RMSD和RMSF。（I–J）MM/GBSA计算结合自由能及关键残基贡献，Gln228等贡献较大。（K–N）CETSA/SIP验证SIRT3-WT、SIRT3-Q228A、SIRT3-D231A，Q228A显著削弱CA诱导的SIRT3稳定化。（O–S）SIRT3-WT与Q228A回补实验检测CDKN1A、TP53、COL1A1、MMP3、MMP9，Q228A取消CA的保护作用。确认Gln228为CA-SIRT3关键结合位点。

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Fig.7｜CA通过SIRT3依赖的FOXO3 K271去乙酰化及核转位激活PINK1转录。（A）SIRT3-FOXO3等相关蛋白互作网络。（B）GSE240226中SIRT3与FOXO3等基因相关性。（C–H）UVB及CA处理后SIRT3、FOXO3表达及SIRT3-FOXO3共免疫沉淀。（I–L）CoIP检测SIRT3与FOXO3互作及FOXO3总体乙酰化。（M–N）Honokiol、2-APQC和CA处理后FOXO3总体乙酰化。（O–R）免疫印迹检测FOXO3核转位及K271位点乙酰化。（S–AB）FOXO3-WT/K271R、SIRT3-WT/Q228A突变体验证K271去乙酰化和核积累。（AC）PINK1启动子−2000至−1 bp的9对引物示意图。（AD）CUT&Tag-qPCR检测FOXO3在PINK1启动子各区域的富集，定位至−800至−301 bp。（AE）JASPAR预测PINK1启动子−550至−546 bp的AAACA响应元件。（AF）双荧光素酶报告基因检测PINK1-WT和AAACA突变型在Control、UVB、UVB+CA下的启动子活性，突变后CA激活作用消失。说明FOXO3直接转录调控PINK1。

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Fig.8｜AAV9介导Sirt3敲低在体内削弱CA抗光老化作用。小鼠背部皮内注射AAV9-shNC或AAV9-shSirt3，随后慢性UVB照射并局部给予CA。（A）背部皮肤外观。（B–E）皮肤光老化评分、捏起恢复时间、皮肤水合度、羟脯氨酸含量。（F）HE染色及表皮厚度。（G）Masson和EVG染色评估胶原沉积和弹性纤维组织。（H–J）qPCR检测Col1a1、Mmp3、Mmp9。（K–M）检测SOD、GSH-Px和MDA。（N–P）qPCR检测Il6、Il1b、Tnf。（Q）亚细胞分离和免疫印迹检测FOXO3在胞质/核中的分布。（R）qPCR检测Pink1。（S）免疫印迹检测LC3B-II和p62。结果显示Sirt3敲低削弱CA对光老化表型、ECM、氧化炎症、FOXO3核转位、PINK1表达和自噬通量的改善，体内验证SIRT3依赖性。

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