WB，一个科研界的「神级」实验，拥有着非常独特的品质：神秘、强大、有影响力。
神秘：漂亮的 WB 条带就像鬼，人人都说有但是从来没人在实验室里见过。
强大：很难被实验技巧所干预，身经百战的科研老司机也会遭遇 WB 的背刺！
有影响力：影响范围极其广泛，从研一到博后，甚至导师面对之，也会望而却步。
一次 WB 至少 36 个小时，曝光条带「开盲盒」的时候，映入眼帘的往往是：脏背景、信号弱、大气泡、歪条带，甚至没条带.......
学霸君为大家整理了 6 个异常条带的原因以及修正策略。
文末还附上了科研人 WB 专项训练，一周跟练，让你的 WB 得到质的提升。
脏脏带 —— 高背景条带
来源：丁香实验
高背景是 WB 中最常见的问题之一，它会严重干扰条带的辨识。看着丑、ImageJ 也分析不出来，基本等于无用条带。拿到它也就证明你浪费了宝贵的 36 小时。
可能原因 & 对策：
洗涤可能不充分：使用含 Tween-20 的 PBST 作为洗涤液，增加洗涤次数至 3-5 次，每次 5 分钟。
封闭不充分：尝试使用 BSA 或其他低内毒素封闭液替代牛奶，减少非特异性结合。
抗体本身问题：实验前对一抗进行预吸附处理，去除可能的交叉反应成分。* 选用纯化抗原、过表达裂解物或同源蛋白填充柱/管，加入一抗孵育后离心或过滤，弃去溶液保留抗体，以此减少 WB 非特异性结合。
弯弯带 —— 偏移条带
来源：丁香实验
有时，曝光后会突然出现凹凸不平或者偏移的条带。这些条带位置不准确的情况，常见于科研小白（或者让小白帮你配胶的科研大佬）因为这些条带很可能是胶引起的。
可能原因 & 对策：
凝胶聚合不均匀：灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓。（见文末专项训练）
分离胶凝固问题：凝固时可用 1 mL 无水乙醇覆盖分离胶液面，阻断空气，分隔线会更加平直，也会减少 「微笑」 或 「倒微笑」 等弯弯条带的出现。
胶板底部有气泡：这些气泡会影响电泳效果，开始电泳前应倾斜电泳装置，赶走气泡。
淡淡带 —— 很淡很淡的条带
来源：丁香实验
这种杂交信号很弱的条带往往出自老司机之手，并非操作问题，而是蛋白量、抗体量、转膜时间估算出现了问题。（不提前计算好时间、细节而盲目自信导致的）。
很可惜！这类条带虽然能看出趋势，但是对于数据统计和文章发表来说依旧不够标准。
可能原因 & 对策：
蛋白量太少：可以适当增加蛋白上样量（通常一孔 20-100μg 总蛋白）
抗体效价太低：可以适当加大抗体浓度，或者更换其他抗体过度漂洗膜：这也可能会导致信号变弱、条带太浅;
转移到膜上的蛋白太少：当蛋白分子量 <10 KD 时，可减少转膜时间、使用小孔径的膜或配置厚度适当的凝胶。
粘连带 —— 连在一起的条带
来源：丁香实验
条带连在一起，通常意味着实验中存在一些「技术问题」，这样的条带降低了分辨率，不同孔的蛋白条带无法清晰区分，基本无法统计。
以下是可能的原因及相应的对策：
可能原因 & 对策：
上样量过大：减少上样量至推荐范围（通常 20-100μg 总蛋白），可先尝试减半上样量。
一抗孵育时间过长：缩短一抗孵育时间，一般 4°C 过夜较为合适，或按抗体说明书推荐时间执行。
加样孔残留胶：拔梳子后彻底冲洗并吸干加样孔，避免胶残留导致扩散。
上样速度慢导致扩散：快速且均匀地上样，减少样品在孔口的停留时间。
APS（过硫酸铵）长时间存放：确保每次使用新配制的 APS，避免因降解导致的问题。
装板不紧密：确保电泳胶与膜、膜与滤纸间装配紧密，减少漏电。
点点带 —— 出现黑点的模糊条带
来源：丁香实验
这类条带的出现，可能与多种操作问题相关，包括抗体、转膜、操作污染，需要一一排查。
可能原因 & 对策：
抗体沉淀：抗体使用前充分混匀并短暂离心，避免抗体颗粒形成。ECL 试剂不均：确保 ECL 试剂新鲜并均匀涂抹，可轻轻摇晃混合后再使用。
膜过于干燥：在操作过程中保持膜湿润，避免膜在空气中暴露过久。抗体稀释液问题：使用无菌、无颗粒的 PBS 或 TBST 稀释抗体，确保溶液干净。
膜质量问题：更换高质量 PVDF 或 NC 膜，避免使用劣质或破损的膜。
操作污染：实验全程戴手套，使用无菌操作，避免灰尘和异物落入。
泡泡带 —— 出现气泡、杂质的条带
来源：丁香实验
很多人认为泡泡带一定是转膜时产生气泡，但其实还可能有以下问题。
可能原因 & 对策：
转膜时产生气泡：转膜前用缓冲液预湿膜，转膜时缓慢放下，用吸水纸轻压排出气泡。
电泳胶不平整：确保凝胶和电泳槽底部贴合紧密，使用夹子固定，防止气泡生成。
样品含有颗粒：使用超声波破碎或过滤样品，去除颗粒物，确保样品纯净。
封闭不充分：适当延长封闭时间，使用足够的封闭液量，确保膜全面覆盖。
没有带 —— 我条带呢？
来源：丁香实验
最后，很多同学可能会经历没有条带的 WB 条带，遇到这种问题可先别想着重新做实验，把条带丢掉，其实你的条带可能还有救。
可能原因 & 对策：
抗体失效：验证抗体活性，更换新批次抗体再试一次，如仍没有条带可能是以下问题。
电泳或转膜失败：检查电泳缓冲液、凝胶浓度和转膜时间，确保电泳和转膜过程正常。
样品降解：使用蛋白酶抑制剂，快速冷冻样品，防止蛋白在提取和处理过程中降解。
膜过度清洗：减少洗涤次数或缩短每次洗涤时间，避免过度清洗导致信号减弱。
以上就是 6 个异常条带的原因以及修正策略，掌握了上述策略，下一步就是将其转化为实际操作的肌肉记忆啦。
学霸君为你设计了更具挑战性和实用性的专项练习，快收藏本文，一起进步吧！
最后，请查收 WB 人一周专项训练，跟着学霸君练起来！
周一：配胶 *3 板（8%、10%、12%），锻炼手部稳定性
周二：挑出最佳胶板跑胶 *1 次，计算电压并记录时间
周三：自己转膜 *1 次；临摹师兄师姐转膜 *1 次
周四：1 分钟速度叠船 *10 只（各种尺寸大小）
周五：休息日，检查实验笔记并复盘。
相信我，连续坚持 3 周下来，你的 WB 也可以有质的提升。
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