提起蛋白质印迹法（Western blotting，WB）、免疫沉淀法、染色质免疫沉淀技术等蛋白鉴定方法，其中形形色色诡异的玄学让不少科研新手头疼不已。想必咱们学霸的读者最有发言权，踩过无数蛋白鉴定的坑、吃过无数抗体的亏，才能成功发表论文呀。
以生化实验室里最常用的 WB 实验为例，有人反复多次做 WB 实验，却始终只能得到一张白膜，抗体换新、调整转膜时间却依然没有条带转膜，甚至连公认好染的 actin 蛋白都不愿「赏脸」染上。
来源：丁香实验
有人 WB 实验则过于「赏脸」，一张膜上出现了各种各样的特异性蛋白条带，唯独没有自己想要的那条带。而此种情况绝大多数是因为一抗不好, 让人无法判断哪一条是目的条带。
来源：网络
于是，实验人不断地怀疑自己、自我攻略，试图俘获 WB 实验女神的芳心。
于是，无数解决方法层出不穷地出现：
条带拖尾怎么办？根据情况调整一抗浓度，孵育时间也可适当缩短。
出现非特异性条带怎么办？更换品质更好的一抗。
高背景怎么办？可能是封闭液溶解不完全或者封闭液存放时间太久，可能是膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合，一抗浓度过高，洗膜时间次数不够。
抗体失效乱象频发，让人始料未及
一生辛勤的硕博生们在面对实验失败时，第一时间总是自我检查、反省和改进。然而，令人破防的是，一直在找自己的原因，却未想过被试剂商背刺。
最近，发表在 Nature 杂志的一篇论文，直击要害，指出人们很熟悉或遭受的一个问题：我们日常使用的抗体往往性能不佳。这些抗体正在毁灭实验的正常进程。
来源：Nature 杂志
早在 10 年前，Nature 杂志就发表过类似的评论文章，称抗体的错误充斥着生物实验领域。
来源：Nature 杂志
例如，很多商用抗体经常无法识别特定的蛋白或者非选择性地与其他几个靶标结合，也就是大家遇到的「非特异性结合」痛点，结果白白浪费了人们的时间和资源，这导致了生物科学的「可重复危机」不断爆发。
以常见的 TRPA1 抗体为例，在三种被广泛引用的商用抗体中，有两种根本无法检测到目标蛋白，第三种还与完全不相关的蛋白结合。
更令人心惊的是，曾有专业团队评估了 614 种商业抗体，其中针对了 65 种神经科学相关蛋白质展开探索，发现三分之二的抗体没有按照制造商的建议发挥作用。这是一个惊人的失败率！
与此同时不断有网友现身说法，讲述自己使用抗体的血泪史。有的抗体出现一堆杂带，数量高至 8 条， 有的抗体使用说明书引用的文献都是假的，让人大跌眼镜。还有小伙伴不断怀疑自我，认为实验失败是个人操作有误，想破脑袋也没有想到是抗体本身质量过差！看来 有时候买抗体也是一种看运气的玄学了！
抗体质量不佳，值得人警惕
Nature 杂志曾针对 1,576 名科研人员进行网络调查，结果显示，超 70% 的科研人员无法重复他人的实验结果，超 50% 无法重复自己的实验结果。谈及原因，除了实验本身和监管之外，还有试剂的不稳定性。
正如上文所说，商用质量抗体差，浪费了人力物力和时间资源，严重阻碍了实验的正常进展。然而，这只是显性不良影响，其隐性不良影响却在悄悄地发酵。
例如，Cell 杂志直接提出需要提供 WB 实验各个环节的原始数据和图像，如果未按时提交，文章可能推迟发表或存在撤稿风险。
Nature 杂志明确要求提出要提交未经裁剪图像，内参和目的蛋白在同一张膜上，尽量不跑平行胶，以保证实验数据的准确性。
来源：Cell 杂志
假如在回复审稿意见时，作者需要补充蛋白鉴定实验，提供完整的过程性图片，却发现往日购买的抗体质量忽高忽低，重复不出来实验结果，那真的是欲哭无泪了。
众所周知，随着科研界对于学术诚信的日益看重，对于实验结果可重复性要求越来越高。倘若实验结果重复不出来，那么呕心沥血做出的实验成果很可能面临被拒稿乃至撤稿的风险，不仅阻碍个人科研进展，而且损害学术名誉。
数月前，一篇发表在三年前的论文被撤稿。这篇论文的研究结果证实 DNMT3B 蛋白在退化的大鼠椎间盘组织中仅有微弱表达。
然而，当他们面对编辑的要求，再次进行动物实验时，却无法获得与最初研究一致的结果。
即「DNMT3B 通过 TRPA1-COX2-YAP 轴缓解 IVDD 」中的体内数据无法再现，因此作者们一致同意撤稿。这么多么沉痛的教训！
除了人为造假导致实验无法重复的原因之外，我们也要警惕和正视抗体质量差可能导致实验无法重复的现实，并及时作出应对。
首先，不同批次的抗体间差异也可能产生截然不同的结果。
研究人员不应对供应商提供的信息百分百信任，应该检查抗体是否已针对特定应用和组织类型进行了测试，但供应商提供的信息质量可能存在很大差异。
其次，科研人员要谨慎判断所在使用的抗体，需要针对自己的检测实验进行有效性的验证，更要意识到在实验中加入阴性对照的重要性。
例如，遗传验证（Genetic validation）、正交验证（Orthogonal validation）、独立抗体验证（Independent antibody validation）、重组表达验证（Recombinant expression validation）、免疫捕获加上质谱分析验证（Capture MS validation），可根据实际情况选择。
最后，试剂供应商也要注重品牌的质量和声誉，努力提高抗体的质量和性能！
题图来源：图虫创意
我们长期为科研用户提供前沿资讯、实验方法、选品推荐等服务，并且组建了 70 多个不同领域的专业交流群，覆盖PCR、细胞实验、蛋白研究、神经科学、肿瘤免疫、基因编辑、外泌体、类器官等领域，定期分享实验干货、文献解读等活动。
添加实验菌企微，回复【】中的序号，即可领取对应的资料包哦～
【2401】论文写作干货资料（100 页）
【2402】国内重点实验室分子生物学实验方法汇总（60 页）
【2403】2024 最新最全影响因子（20000+ 期刊目录）
【2404】免疫学信号通路手册
【2405】PCR 实验 protocol 汇总
【2406】免疫荧光实验 protocol 合集
【2407】细胞培养手册
【2408】蛋白纯化实验手册
热门跟贴