2025年3月20日，西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室沈亚欧教授团队和中国科学院青岛生物能源与过程研究所能源作物分子育种研究组刘敏博士联合在Molecular Plant发表了题为Dynamic transcriptome and GWAS uncover that a hydroxyproline-rich glycoprotein suppresses Agrobacterium-mediated transformation in maize的研究论文，该研究鉴定了参与农杆菌介导的玉米幼胚转化的关键基因，并建立了高效玉米遗传转化体系。
研究背景
玉米（Zea mays L.）作为全球产量最高的粮食作物，在食品加工、畜牧养殖及生物能源等领域占据核心地位。通过现代生物育种技术提升玉米产量、品质和环境适应性是玉米遗传改良的重要研究方向。转基因和基因编辑是玉米生物育种领域的革命性技术，其高度依赖于农杆菌介导的幼胚遗传转化。然而，大多数玉米种质遗传转化率低，不能直接作为转化受体，成为玉米生物育种的瓶颈因素。挖掘玉米中调控农杆菌转化的关键基因，对建立优良玉米品系的高效遗传转化和基因组编辑体系、加速玉米遗传改良进程具有重要意义。
研究内容
为解除玉米遗传转化的基因型依赖性，本研究自主开发了农杆菌侵染率的精准定量方法（图1），并整合动态转录组与全基因组关联分析（GWAS）鉴定了玉米中调控农杆菌侵染率（AIF）的变异位点和关键基因。通过对玉米幼胚在农杆菌侵染和共培养阶段的动态转录组分析，在低侵染率自交系18-599R和高侵染率自交系A188中分别鉴定到8483个和1580个基因型特异性响应基因。共表达网络分析（WGCNA）进一步揭示两个自交系中各存在5个和7个农杆菌共培养阶段特异性表达模块。同时，结合310份自交系的基因型和两环境表型数据并进行 GWAS，关联到30个单核苷酸多态性位点（SNPs）和315个候选基因，整合GWAS与WGCNA结果筛选到12个与A188高侵染率密切相关的关键基因（图2）。CRISPR/Cas9介导的基因敲除证明，富含羟脯氨酸糖蛋白ZmHRGP是负向调控玉米幼胚侵染率的关键因子（图3）。在18-599R中敲除ZmHRGP后，幼胚的农杆菌侵染率由的36%提高90%，转化率由11%提高到80%（图4）。此外，通过RNAi瞬时抑制ZmHRGP表达也可显著提高玉米愈伤组织和叶片的农杆菌侵染率。本研究完善了植物响应农杆菌侵染的分子机制，为建立基因型普适性玉米遗传转化体系提供了新策略。
图1 利用自主研发的表型评价方法精准定量玉米18-599R和A188自交系幼胚的农杆菌侵染频率
幼胚的农杆菌侵染率表型评价难度大，为精准评估玉米幼胚的侵染率，本研究自主研发了一种基于增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达量的定量方法。将玉米泛素蛋白基因ZmUbiquitin1的第一内含子插入eGFP编码区改造成eGFP-intron，将其导入农杆菌中并侵染玉米幼胚。eGFP-intron在缺乏内含子剪接机制的农杆菌细胞中不表达eGFP蛋白，只有当eGFP基因输入幼胚细胞后才能进行正常表达。因此，在荧光显微镜下检测到的绿色荧光则为在幼胚中表达的eGFP蛋白。该设计有效避免了农杆菌细胞荧光对玉米幼胚细胞荧光的污染。同时，设计跨内含子的eGFP定量引物对侵染后的幼胚进行eGFP的RT-qPCR分析，避免农杆菌携带的eGFP-intron序列对幼胚细胞中eGFP成熟mRNA表达量的影响，实现通过幼胚中eGFP的RT-qPCR定量农杆菌侵染率。最后，结合幼胚的荧光密度与eGFP成熟mRNA的丰度，实现对玉米幼胚侵染率的准确评估（图1）。
图2 联合分析WGCNA和GWAS鉴定玉米农杆菌侵染率的关键基因
利用侵染率表型具有显著差异的自交系18-599R（低AIF）和A188（高AIF）的幼胚，在农杆菌侵染和共培养过程中动态取样进行比较转录组分析，通过WGCNA和基因型特异性共表达模块分析，鉴定到1261个A188特异响应农杆菌侵染的基因（图2C）。使用本研究建立的AIF定量方法，研究人员评估了310份玉米自交系在西双版纳和成都两环境下的表型，包括侵染后36 h、48 h和72 h的AIF。利用GWAS鉴定到30个AIF相关的SNPs，注释到315个候选基因（图2A）。结合上述WGCNA鉴定到的A188特异响应基因，共获得12个与侵染率相关的候选基因（图2D）。其中，在高AIF自交系A188、C01和 B104 中一致低表达，而在低AIF自交系18-599R中高表达的基因ZmHRGP（图2E）受到进一步关注。
图3 敲除ZmHRGP后玉米幼胚的农杆菌侵染率显著提高
利用CRISPR/Cas9系统在低AIF自交系18-599R中敲除ZmHRGP基因，大幅度提高了农杆菌侵染效率（图3）。另外，基于ZmHRGP敲除材料，本研究建立了农杆菌介导的高效遗传转化体系，幼胚转化率由11%提高至80%（图4）。同时，本研究还利用RNAi抑制ZmHRGP表达，验证了瞬时抑制ZmHRGP表达也可显著提升玉米愈伤组织和叶片的农杆菌侵染效率。
图4 基于18-599R的ZmHRGP敲除株系建立高效遗传转化体系
作者简介
四川农业大学国家重点实验室沈亚欧教授为该论文的通讯作者，四川农业大学毕业博士刘敏（现为中国科学院青岛生物能源与过程研究所能源作物分子育种研究组助理研究员）。四川农业大学潘光堂教授、马浪浪副教授、邹超英老师对本研究作出了重要贡献。四川农业大学毕业硕士阳燕、博士后梁天虎、侯凤霞、博士生张敏燕、何世江、毕业博士刘鹏参与了研究工作。本研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、山东省自然科学基金等项目资助。
文章链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205225001017
来源： 西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室
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